Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

Sintesi Tecnica: Arricchimento di cellule marcate con microlaser tramite sistemi commerciali di citometria a flusso per il sorting cellulare

Problema
I microlaser a modo di galleria risonante (WGM), tipicamente particelle di polistirene (LP) dopate con colorante fluorescente, offrono vantaggi unici per l'etichettatura cellulare ad alta risoluzione, il tracciamento della singola cellula e il biosensing grazie alla loro emissione brillante e spettralmente stretta. Tuttavia, esiste un collo di bottiglia critico nell'applicazione di questi strumenti in contesti biomedici e di ingegneria tissutale: l'incapacità di controllare in modo riproducibile il numero di LP all'interno di una popolazione cellulare. Sebbene sia possibile identificare migliaia di cellule marcate in coltura, garantire una purezza e una composizione definita della popolazione cellulare sottostante rispetto alla densità di marcatura con LP è essenziale per applicazioni avanzate. I metodi esistenti per il sorting delle cellule basati sui codici a barre spettrali degli LP internalizzati si affidano a configurazioni microfluidiche personalizzate e sistemi ottici complessi, che sono difficili da costruire, mantenere e operare, limitando la loro accessibilità a strutture specializzate di analisi (core facilities).

Metodologia
Gli autori hanno sviluppato un workflow che utilizza sistemi commerciali di citometria a flusso e sorting cellulare ampiamente disponibili per purificare popolazioni cellulari contenenti grandi LP senza ricorrere a microfluidica personalizzata.

• Selezione e Caratterizzazione delle Particelle: Sono stati confrontati due tipi di LP commerciali (LP-A e LP-B). Le loro prestazioni di lasing, la brillantezza della fotoluminescenza (PL), la distribuzione dimensionale e l'uniformità sono state caratterizzate mediante pompaggio ottico, citometria a flusso (FSC-A, SSC-A, Red-PL) e microscopia a campo chiaro.
• Modifica Superficiale: Per migliorare l'associazione LP-cellula, la superficie delle LP è stata modificata con poli(etilenimmina) (PEI) o lipofectamina per invertire la loro carica superficiale da negativa a positiva, promuovendo l'interazione con la membrana cellulare cariche negativamente.
• Strategia di Sorting: Cellule HEK293T sono state incubate con LP e sortate utilizzando un BD FACSAria Fusion. La strategia di gating si è basata sulle proprietà di scattering frontale e laterale (FSC-A, SSC-A) per distinguere tra LP nude, cellule prive di LP (LP-) e cellule contenenti LP (LP+). La vitalità è stata garantita escludendo gli eventi DAPI-positivi (cellule morte). La discriminazione dei singoletti è stata eseguita per escludere gli aggregati.
• Validazione e Analisi: Le popolazioni sortate sono state validate tramite citometria a flusso a immagine. L'interazione fisica tra le LP e le cellule è stata analizzata tramite microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per determinare l'internalizzazione rispetto all'attacco superficiale.
• Applicazione nell'Ingegneria dei Tessuti: Cellule LP+ e LP- sono state sortate, miscelate a rapporti definiti e seminate in piastre a bassa adesione per formare sferoidi multicellulari. Questi sferoidi sono stati scansionati con un microscopio confocale iperspettrale per rilevare i segnali di lasing e calcolare i diametri delle LP basandosi sugli spettri di emissione.

Risultati Chiave

• Prestazioni e Uniformità delle LP: LP-B ha mostrato prestazioni di lasing superiori, con un lasing robusto a basse energie di pompaggio (4 nJ) rispetto a LP-A, che richiedeva energie più elevate e mostrava un'efficienza di lasing inferiore. La citometria a flusso ha rivelato che LP-B possedeva una maggiore brillantezza e una distribuzione dimensionale più stretta, mentre LP-A mostrava una maggiore etogeneità in termini di dimensione e contenuto del mezzo di guadagno.
• Modifica Superficiale e Uptake: Le LP non rivestite mostravano un attaccamento variabile; LP-A si attaccava o veniva internalizzata dalle cellule, mentre LP-B mostrava un attacco minimo. Il rivestimento con PEI o lipofectamina ha migliorato significativamente l'associazione cellulare. Le LP rivestite con PEI hanno mostrato l'interazione più forte, con le LP localizzate esclusivamente sulle cellule dopo il lavaggio.
• Efficienza di Sorting e Vitalità Cellulare: Il sorter commerciale ha separato con successo le popolazioni LP+, LP- e le LP nude. Tuttavia, sono state osservate differenze dipendenti dal produttore: LP-A ha mostrato un'efficienza di internalizzazione superiore (il 19,2% degli eventi era LP+) rispetto a LP-B (5,1%). Mentre le cellule associate a LP-A mantenevano tassi di proliferazione simili ai controlli, le cellule associate a LP-B (sia la frazione LP+ che quella LP-) hanno mostrato una riduzione della confluenza di circa il 20% dopo 5 giorni, suggerendo un potenziale effetto inibitorio di LP-B sulla crescita cellulare.
• Meccanismo di Interazione: Le immagini SEM e TEM hanno rivelato meccanismi di interazione distinti. Le LP-A sono state completamente internalizzate, con la membrana cellulare che avvolgeva completamente la particella ponendola in diretto contatto con il citosol. Al contrario, le LP-B sono state solo parzialmente avvolte, formando una coppa di membrana attorno alla particella senza contatto diretto con il citosol.
• Ingegneria degli Sferoidi: L'approccio di sorting ha permesso la generazione di sferoidi con rapporti definiti tra cellule contenenti LP e cellule prive di LP. I segnali di lasing sono stati rilevabili fino a 300 µm di profondità all'interno degli sferoidi, e i diametri delle singole LP potevano essere calcolati dagli spettri di emissione, anche in tessuti otticamente densi.

Significatività e Rivendicazioni
Il documento sostiene di aver gettato le basi per studi più ampi sull'ingegneria dei tessuti, dimostrando che i sistemi commerciali di citometria a flusso possono essere efficacemente adattati per la purificazione e l'analisi di cellule marcate con microlaser di grandi dimensioni. Gli autori affermano che questo approccio basato sullo scattering elimina la necessità di configurazioni microfluidiche complesse e personalizzate, rendendo l'etichettatura ottica ad alta risoluzione e il tracciamento della singola cellula più accessibili.

Inoltre, lo studio evidenzia l'importanza di caratterizzare le proprietà delle LP (uniformità, brillantezza) e la chimica superficiale, poiché questi fattori influenzano criticamente le prestazioni di lasing, i meccanismi di uptake cellulare e la vitalità cellulare. La capacità di controllare con precisionzza la densità delle LP all'interno degli sferoidi apre nuove strade per il sensing in tessuti profondi e l'indagine sistematica delle interazioni cellula-particella. Infine, gli autori suggeriscono che questo framework fornisce un modello robusto per studiare l'impatto fisiologico delle microplastiche ambientali sulla salute umana, data la capacità di tracciare e monitorare tali particelle a livello di singola cellula.