Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

技術要約：市販のフローサイトメトリーによる細胞選別システムを用いたマイクロレーザー標識細胞の高度化

問題提起
ウィスパーリング・ギャラリー・モード（WGM）マイクロレーザーは、一般に蛍光色素をドープしたポリスチレン粒子（LP）であり、その明るくスペクトル幅の狭い発光により、高解能な細胞タグ付け、単一細胞トラッキング、およびバイオセンシングにおいて独自の利点を提供します。しかし、生物医学および組織工学の文脈にこれらを適用する上で、決定的なボトルネックが存在します。それは、細胞集団内におけるLPの数を再現性よく制御できないことです。培養液中では数千個の標識された細胞を識別できるものの、高度なアプリケーションにおいては、内部化されたLPの標識密度に関して、基礎となる細胞集団の明確な純度と組成を確保することが不可欠です。LPのスペクトル・バーコードに基づいて細胞を選別する既存の手法は、カスタム構築されたマイクロ流体セットアップや複雑な光学系に依存しており、これらは構築、維持、操作が困難であるため、専門的なコア施設へのアクセスを制限しています。

手法
著者らは、カスタムマイクロ流体を用いずに、広く普及している市販のフローサイトメトリーおよび細胞選別システムを利用したワークフローを開発しました。

• 粒子の選択と特性評価： 2種類の市販LP（LP-AおよびLP-B）を比較しました。これらのレーザー性能、フォトルミネセンス（PL）輝度、サイズ分布、および均一性を、光ポンプ、フローサイトメトリー（FSC-A、SSC-A、Red-PL）、および明視野顕微鏡を用いて特性評価しました。
• 表面修飾： LPと細胞の結合を高めるために、LP表面をポリ（エチレンイミン）（PEI）またはリポフェクタミンで修飾し、表面電荷を負から正に反転させることで、負に帯電した細胞膜との相互作用を促進しました。
• 選別戦略： HEK293T細胞をLPとインキュベートし、BD FACSAria Fusionを用いて選別しました。ゲーティング戦略は、前方散乱および側方散乱特性（FSC-A、SSC-A）に基づき、裸のLP、LPフリー細胞（LP-）、およびLP含有細胞（LP+）を区別することに依拠しました。生存率は、DAPI陽性イベントを除外することで確保されました。凝集塊を除外するために、シングレット判別が行われました。
• 検証と分析： 選別された集団は、イメージングフローサイトメトリーを用いて検証されました。LPと細胞の物理的相互作用は、走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて分析され、内部化か表面付着かを決定しました。
• 組織工学への応用： 選別されたLP+細胞とLP-細胞を定義された比率で混合し、超低接着プレートに播種して多細胞スフェロイドを形成しました。これらのスフェロイドをハイパースペクトル共焦点顕微鏡でスキャンし、レーザー信号を検出して、放出スペクトルから個々のLP径を算出しました。

主な結果

• LPの性能と均一性： LP-Bは、LP-Aがより高いエネルギーを必要とし、レーザー効率も低かったのに対し、低いポンプエネルギー（4 nJ）で堅牢なレーザー発振を示す、優れたレーザー性能を示しました。フローサイトメトリーにより、LP-Bは高い輝度と狭いサイズ分布を持つことが明らかになった一方、LP-Aはサイズおよびゲイン媒体の内容において広い不均一性を示しました。
• 表面修飾と取り込み： 未コーティングのLPは変動的な付着を示しました。LP-Aは細胞に付着または内部化されましたが、LP-Bは最小限の付着しか示しませんでした。PEIまたはリポフェクタミンによるコーティングは、細胞との結合を著しく改善しました。PEIコーティングされたLPは最も強い相互作用を示し、洗浄後もLPは細胞上にのみ局在していました。
• 選別効率と細胞生存率： 市販のソーターは、LP+、LP-、および裸のLP集団を正常に分離しました。しかし、製造業者に依存する差異が観察されました。LP-Aは、LP-B（5.1%がLP+）と比較して高い内部化効率（19.2%がLP+）を示しました。LP-Aと結合した細胞はコントロールと同様の増殖率を維持しましたが、LP-Bと結合した細胞（LP+およびLP-の両方の画分）は、5日後にコンフルエンシーが約20%減少しており、LP-Bが細胞増殖に対して抑制効果を持つ可能性を示唆しました。
• 相互作用のメカニズム： SEMおよびTEMによるイメージングは、異なる相互作用メカニズムを明らかにしました。LP-Aは完全に内部化され、細胞膜が粒子を完全に包み込み、細胞質と直接接触させていました。対照的に、LP-Bは部分的に包み込まれるのみで、粒子に対して細胞膜のカップを形成しましたが、細胞質との直接接触は生じていませんでした。
• スフェロイド工学： この選別アプローチにより、LP含有細胞とLPフリー細胞を定義された比率で含むスフェロイドの生成が可能になりました。レーザー信号は、光学的に密な組織内であっても、300 µmの深さまで検出可能であり、放出スペクトルから個々のLP径を算出することができました。

意義および主張
本論文は、市販のフローサイトメトリーシステムが、大型のマイクロレーザーで標識された細胞の精製および分析に効果的に適応できることを示すことで、より大規模な組織工学研究の基礎を確立したと主張しています。著者らは、この散乱ベースのアプローチが、複雑でカスタム構築されたマイクロ流体セットアップの必要性を排除し、高解像度の光学タグ付けおよび単一細胞トラッキングへのアクセスを容易にすると断言しています。

さらに、本研究は、LPの特性（均一性、輝度）および表面化学の特性評価が、レーザー性能、細胞取り込みメカニズム、および細胞生存率に決定的な影響を与えることを強調しています。スフェロイド内のLP密度の精密な制御能力は、深部組織センシングおよび細胞・粒子間相互作用の系統的な調査への新たな道を切り開きます。最後に、著者らは、単一細胞レベルでの粒子追跡およびモニタリング能力を考慮すると、本フレームワークが環境マイクロプラスティクスの生理学的影響を研究するための堅牢なモデルを提供すると示唆しています。