Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems
Deze studie toont aan dat commerciële op flowcytometrie gebaseerde sortering, gecombineerd met oppervlaktemodificeerde polystyreen laserpartikels, de efficiënte verrijking van HEK293T-cellen met gecontroleerde aantallen microlasers mogelijk maakt, terwijl de celviabiliteit behouden blijft en de creatie van gedefinieerde multiculturele spheroids voor geavanceerde weefseltechnologie-toepassingen wordt gefaciliteerd.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Technische Samenvatting: Verrijking van met microlasers gelabelde cellen door commerciële op flowcytometrie gebaseerde cel sorteersystemen
Probleemstelling
Whispering-gallery mode (WGM) microlasers, doorgaans polystyreen deeltjes (LPs) gedoteerd met fluorescente kleurstof, bieden unieke voordelen voor hoogwaardige cellulaire tagging, single-cell tracking en biosensing vanwege hun heldere, spectraal smalle emissie. Er bestaat echter een kritieke flessenhals bij het toepassen van deze instrumenten in biomedische en weefseltechnologische contexten: het onvermogen om op reproduceerbare wijze het aantal LPs binnen een celpopulatie te controleren. Hoewel duizenden gelabelde cellen in cultuur geïdentificeerd kunnen worden, is het waarborgen van een gedefinieerde zuiverheid en compositie van de onderliggende celpopulatie met betrekking tot de LP-labelingsdichtheid essentieel voor geavanceerde toepassingen. Bestaande methoden voor het sorteren van cellen op basis van de spectrale barcodes van geïnternaliseerde LPs vertrouwen op op maat gemaakte microfluidische opstellingen en complexe optische systemen, die moeilijk te bouwen, te onderhouden en te bedienen zijn, wat de toegankelijkheid beperkt tot gespecialiseerde core-faciliteiten.
Methodologie
De auteurs hebben een workflow ontwikkeld die gebruikmaakt van algemeen beschikbare commerciële flowcytometrie- en celsorteersystemen om celpopulaties die grote LPs bevatten te zuiveren zonder aangepaste microfluidica.
- Selectie en karakterisering van deeltjes: Twee soorten commerciële LPs (LP-A en LP-B) werden vergeleken. Hun lasing-prestaties, fotoluminescentie (PL) helderheid, grootteverdeling en uniformiteit werden gekarakteriseerd met behulp van optische pomp, flowcytometrie (FSC-A, SSC-A, Red-PL) en brightfield microscopie.
- Oppervlaktemodificatie: Om de associatie tussen LP en cel te verbeteren, werd het oppervlak van de LPs gemodificeerd met poly(ethyleenimine) (PEI) of lipofectamine om de oppervlaktelading te veranderen van negatief naar positief, wat de interactie met het negatief geladen celmembraan bevordert.
- Sorteerstrategie: HEK293T-cellen werden geïncubeerd met LPs en gesorteerd met behulp van een BD FACSAria Fusion. De gating-strategie vertrouwde op voorwaarts- en zijwaartse scattering eigenschappen (FSC-A, SSC-A) om te differentiëren tussen kale LPs, LP-vrije cellen (LP-) en LP-bevattende cellen (LP+). Viabiliteit werd gewaarborgd door DAPI-positieve events (dode cellen) uit te sluiten. Singlet-discriminatie werd uitgevoerd om aggregaten uit te sluiten.
- Validatie en Analyse: Gesorteerde populaties werden gevalideerd met imaging flowcytometrie. De fysieke interactie tussen LPs en cellen werd geanalyseerd via Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) en Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) om internalisatie versus oppervlakte-hechting te bepalen.
- Toepassing in Weefseltechnologie: Gesorteerde LP+ en LP- cellen werden gemengd in gedefinieerde ratio's en gezaaid in ultra-low attachment platen om multiculturele sferoïden te vormen. Deze sferoïden werden gescand met een hyperspectraleal microscoop om lasing-signalen te detecteren en LP-diameters te berekenen op basis van emissiespectra.
Belangrijkste Resultaten
- LP-prestaties en Uniformiteit: LP-B vertoonde superieure lasing-prestaties, met robuuste lasing bij lage pompenergieën (4 nJ) vergeleken met LP-A, dat hogere energieën vereiste en een lagere lasing-efficiëntie vertoonde. Flowcytometrie onthulde dat LP-B een hogere helderheid en een nauwere grootteverdeling had, terwijl LP-A een bredere heterogeniteit in grootte en gain-medium inhoud vertoonde.
- Oppervlaktemodificatie en Opname: Ongecoate LPs vertoonden variabele hechting; LP-A hechtte aan of werd geïnternaliseerd door cellen, terwijl LP-B minimale hechting vertoonde. Coaten met PEI of lipofectamine verbeterde de cellulaire associatie aanzienlijk. Met PEI gecoate LPs vertoonden de sterkste interactie, waarbij de LPs uitsluitend gelokaliseerd waren op de cellen na wassen.
- Sorteerefficiëntie en Celviabiliteit: De commerciële sorter slaagde erin om LP+, LP- en kale LP-populaties te scheiden. Er werden echter fabrikantafhankelijke verschillen waargenomen: LP-A vertoonde een hogere internalisatie-efficiëntie (19,2% van de events waren LP+) vergeleken met LP-B (5,1%). Terwijl cellen geassocieerd met LP-A vergelijkbare proliferatiesnelheden behielden als de controles, vertoonden cellen geassocieerd met LP-B (zowel de LP+ als de LP- fractie) een reductie in confluentie van ongeveer 20% na 5 dagen, wat wijst op een potentieel inhiberend effect van LP-B op de celgroei.
- Interactiemechanisme: SEM- en TEM-imaging onthulden verschillende interactiemechanismen. LP-A werden volledig geïnternaliseerd, waarbij het celmembraan het deeltje volledig omsloot en het in direct contact bracht met het cytosol. In tegen tegenstelling hiertoe werden LP-B slechts gedeeltelijk omsloten, waarbij een membraanbeker rond het deeltje werd gevormd zonder direct contact met het cytosol.
- Sferoïd Engineering: De sorteerbenadering maakte het mogelijk om sferoïden te genereren met gedefinieerde ratio's van LP-bevattende en LP-vrije cellen. Lasing-signalen waren detecteerbaar tot 300 µm diepte binnen de sferoïden, en individuele LP-diameters konden worden berekend uit de emissiespectra, zelfs in optisch dicht weefsel.
Betekenis en Claims
Het artikel beweert een fundament te leggen voor grotere weefseltechnologische studies door aan te tonen dat commercieel beschikbare flowcytometrie-systemen effectief kunnen worden aangepast voor de zuivering en analyse van cellen gelabeld met grote microlasers. De auteurs stellen dat deze op scatter gebaseerde benadering de noodzaak voor complexe, op maat gemaakte microfluidische opstellingen elimineert, waardoor hoogwaardige optische tagging en single-cell tracking toegankelijker worden.
Verder benadrukt de studie het belang van het karakteriseren van LP-eigenschappen (uniformiteit, helderheid) en de oppervlaktechemie, aangezien deze factoren de lasing-prestaties, cellulaire opname mechanismen en celviabiliteit kritiek beïnvloeden. Het vermogen om de dichtheid van LPs binnen sferoïden nauwkeurig te controleren, opent nieuwe wegen voor diep-weefsel sensing en de systematische studie van cel-deeltje interacties. Ten slotte suggereren de auteurs dat dit framework een robuust model biedt voor het bestuderen van de fysiologische impact van omgevingsmicroplastics op de menselijke gezondheid, gezien het vermogen om deze deeltjes op single-cell niveau te volgen en te monitoren.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.