Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

Technische Zusammenfassung: Anreicherung von mikrolaser-markierten Zellen mittels kommerzieller Durchflusszytometrie-basierter Zellsortiersysteme

Problemstellung
Whispering-Gallery-Mode (WGM) Mikrolaser, typischerweise Polystyrolpartikel (LPs), die mit fluoreszierenden Farbstoffen dotiert sind, bieten einzigartige Vorteile für die hochauflösende zelluläre Markierung, das Single-Cell-Tracking und das Biosensing aufgrund ihrer hellen, spektral schmalen Emission. Es besteht jedoch ein kritisches Hindernis bei der Anwendung dieser Werkzeuge im biomedizinischen und gewebeökologischen Kontext: die Unfähigkeit, die Anzahl der markierten LPs innerhalb einer Zellpopulation reproduzierbar zu kontrollieren. Während tausende markierte Zellen in der Kultur identifiziert werden können, ist die Sicherstellung einer definierten Reinheit und Zusammensetzung der zugrunde liegenden Zellpopulation hinsichtlich der LP-Markierungsdichte für fortgeschrittene Anwendungen essenziell. Bestehende Methoden zur Sortierung von Zellen basierend auf den spektralen Barcodes der internalisierten LPs beruhen auf maßgeschneiderten mikrofluidischen Setups und komplexen optischen Systemen, die schwierig aufzubauen, zu warten und zu bedienen sind, was deren Zugänglichkeit auf spezialisierte Core-Facilities beschränkt.

Methodik
Die Autoren entwickelten einen Workflow unter Verwendung weit verbreiteter kommerzieller Durchflusszytometrie- und Zellsortiersysteme, um Zellpopulationen, die große LPs enthalten, ohne maßgeschneiderte Mikrofluidik zu reinigen.

• Partikelwahl und Charakterisierung: Zwei Arten kommerzieller LPs (LP-A und LP-B) wurden verglichen. Ihre Lasing-Leistung, Photolumineszenz-Helligkeit (PL), Größenverteilung und Uniformität wurden mittels optischer Anregung, Durchflusszytometrie (FSC-A, SSC-A, Red-PL) und Hellfeldmikroskopie charakterisiert.
• Oberflächenmodifikation: Um die LP-Zell-Assoziation zu verbessern, wurden die LP-Oberflächen mit Poly(ethylenimin) (PEI) oder Lipofectamin modifiziert, um ihre Oberflächenladung von negativ zu positiv zu kehren, was die Interaktion mit der negativ geladenen Zellmembran fördert.
• Sortierstrategie: HEK293T-Zellen wurden mit LPs inkubiert und mit einer BD FACSAria Fusion sortiert. Die Gating-Strategie stützte sich auf Streuligkeitseigenschaften (FSC-A, SSC-A), um zwischen nackten LPs, LP-freien Zellen (LP-) und LP-haltigen Zellen (LP+) zu unterscheiden. Die Viabilität wurde durch den Ausschluss von DAPI-positiven Ereignissen (toten Zellen) sichergestellt. Eine Singlet-Diskriminierung wurde durchgeführt, um Aggregate auszuschließen.
• Validierung und Analyse: Sortierte Populationen wurden mittels Imaging-Durchflusszytometrie validiert. Die physikalische Interaktion zwischen LPs und Zellen wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert, um zwischen Internalisierung und Oberflächenadhäsion zu unterscheiden.
• Gewebe-Engineering-Anwendung: Sortierte LP+- und LP--Zellen wurden in definierten Verhältnissen gemischt und in Ultra-Low-Attachment-Platten ausgesät, um multizelluläre Sphäroide zu bilden. Diese Sphäroide wurden mit einem hyperspektralen Konfokalmikroskop gescannt, um Lasing-Signale zu detektieren und LP-Durchmesser basierend auf den Emissionsspektren zu berechnen.

Kernergebnisse

• LP-Leistung und Uniformität: LP-B zeigte eine überlegene Lasing-Leistung und wies ein robustes Lasen bei niedrigen Pumppersonen (4 nJ) auf, im Vergleich zu LP-A, das höhere Energien benötigte und eine geringere Lasing-Effizienz zeigte. Die Durchflusszytometrie ergab, dass LP-B eine höhere Helligkeit und eine engere Größenverteilung aufwies, während LP-A eine breitere Heterogenität in Größe und Gain-Medium-Gehalt zeigte.
• Oberflächenmodifikation und Aufnahme: Unbeschichtete LPs zeigten eine variable Adhäsion; LP-A wurde an Zellen angeheftet oder internalisiert, während LP-B eine minimale Bindung zeigte. Die Beschichtung mit PEI oder Lipofectamine verbesserte die Zellassoziation signifikant. PEI-beschichtete LPs zeigten die stärkste Interaktion, wobei die LPs nach dem Waschen exklusiv auf den Zellen lokalisiert waren.
• Sortiereffizienz und Zellviabilität: Der kommerzielle Sorter konnte erfolgreich zwischen LP+, LP- und nackten LP-Populationen trennen. Es wurden jedoch herstellerabhängige Unterschiede beobachtet: LP-A zeigte eine höhere Internalisierungseffizienz (19,2 % der Ereignisse waren LP+) im Vergleich zu LP-B (5,1 %). Während Zellen, die mit LP-A assoziiert waren, ähnliche Proliferationsraten wie Kontrollen beibehielten, zeigten Zellen, die mit LP-B assoziiert waren (sowohl LP+- als auch LP--Fraktionen), eine Reduktion der Konfluenz um etwa 20 % nach 5 Tagen, was auf einen potenziell inhibitorischen Effekt von LP-B auf das Zellwachstum hindeutet.
• Interaktionsmechanismus: REM- und TEM-Aufnahmen zeigten unterschiedliche Interaktionsmechanismen. LP-A wurden vollständig internalisiert, wobei die Zellmembran das Partikel vollständig umschloss und es in direkten Kontakt mit dem Zytosol brachte. Im Gegensatz dazu wurden LP-B nur teilweise umschlossen, wobei sie eine Membrantasse um das Partikel bildeten, ohne direkten Kontakt zum Zytosol herzustellen.
• Sphäroid-Engineering: Der Sortieransatz ermöglichte die Erzeugung von Sphäroiden mit definierten Verhältnissen von LP-haltigen und LP-freien Zellen. Lasing-Signale waren bis zu einer Tiefe von 300 µm innerhalb der Sphäroide detektierbar, und einzelne LP-Durchmesser konnten aus den Emissionsspektren berechnet werden, selbst in optisch dichten Geweben.

Bedeutung und Ansprüche
Das Paper beansprucht, ein Fundament für größere Gewebe-Engineering-Studien gelegt zu haben, indem es demonstriert, dass kommerziell verfügbare Durchflusszytometrie-Systeme effektiv zur Reinigung und Analyse von Zellen angepasst werden können, die mit großen Mikrolasern markiert sind. Die Autoren behaupten, dass dieser streubasierte Ansatz die Notwendigkeit komplexer, maßgeschneiderter mikrofluidischer Setups eliminiert und somit hochauflösende optische Markierung und Single-Cell-Tracking zugänglicher macht.

Darüber hinaus hebt die Studie die Bedeutung der Charakterisierung von LP-Eigenschaften (Uniformität, Helligkeit) und der Oberflächenchemie hervor, da diese Faktoren die Lasing-Leistung, die zelluläre Aufnahme sowie die Zellviabilität entscheidend beeinflussen. Die Fähigkeit, die Dichte der LPs in Sphäroiden präzise zu kontrollieren, eröffnet neue Wege für die Tiefengewebensensorik und die systematische Untersuchung von Zell-Partikel-Interaktionen. Schließlich legen die Autoren nahe, dass dieser Rahmen ein robustes Modell zur Untersuchung der physiologischen Auswirkungen von Umwelt-Mikroplastik auf die menschliche Gesundheit bietet, gegeben die Fähigkeit, diese Partikel auf Einzelzell-Ebene zu verfolgen und zu überwachen.