Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

Resumo Técnico: Enriquecimento de Células Marcadas com Microlasers por Sistemas Comerciais de Citometria de Fluxo Baseados em Separação Celular

Definição do Problema
Os microlaserses de modo de galeria de sussurro (WGM), tipicamente partículas de poliestireno (LPs) dopadas com corante fluorescente, oferecem vantagens únicas para marcação celular de alta resolução, rastreamento de célula única e biossensoriamento devido à sua emissão brilhante e espectralmente estreita. No entanto, existe um gargalo crítico na aplicação dessas ferramentas em contextos biomédicos e de engenharia de tecidos: a incapacidade de controlar de forma reprodutível o número de LPs dentro de uma população celular. Embora milhares de células marcadas possam ser identificadas em cultura, garantir uma pureza e composição definida da população celular subjacente em relação à densidade de marcação de LP é essencial para aplicações avançadas. Os métodos existentes para separar células baseando-se nos códigos de barras espectrais de LPs internalizados dependem de configurações microfluídicas customizadas e sistemas ópticos complexos, que são difíceis de construir, manter e operar, limitando seu acesso a instalações de núcleos especializados.

Metodologia
Os autores desenvolveram um fluxo de trabalho utilizando sistemas comerciais amplamente disponíveis de citometria de fluxo e separação celular para purificar populações de células contendo grandes LPs sem a necessidade de microfluídica customizada.

• Seleção e Caracterização de Partículas: Dois tipos de LPs comerciais (LP-A e LP-B) foram comparados. Seu desempenho de lasagem, brilho de fotoluminescência (PL), distribuição de tamanho e uniformidade foram caracterizados usando bombeamento óptico, citometria de fluxo (FSC-A, SSC-A, Red-PL) e microscopia de campo claro.
• Modificação de Superfície: Para aumentar a associação LP-célula, as superfícies dos LPs foram modificadas com poli(etilenoimina) (PEI) ou lipofectamina para reverter sua carga superficial de negativa para positiva, promovendo a interação com a membrana celular negativamente carregada.
• Estratégia de Separação: Células HEK293T foram incubadas com LPs e separadas usando um BD FACSAria Fusion. A estratégia de gating baseou-se nas propriedades de espalhamento frontal e lateral (FSC-A, SSC-A) para distinguir entre LPs isolados, células livres de LP (LP-) e células contendo LP (LP+). A viabilidade foi garantida pela exclusão de eventos positivos para DAPI (células mortas). A discriminação de singletos foi realizada para excluir agregados.
• Validação e Análise: As populações separadas foram validadas usando citometria de fluxo de imagem. A interação física entre os LPs e as células foi analisada via Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) para determinar a internalização versus a adesão superficial.
• Aplicação em Engenharia de Tecidos: Células LP+ e LP- foram misturadas em proporções definidas e semeadas em placas de ultra-baixa adesão para formar esferoides multicelulares. Esses esferoides foram escaneados usando um microscópio confocal hiperespectral para detectar sinais de lasagem e calcular os diâmetros dos LPs com base nos espectros de emissão.

Principais Resultados

• Desempenho e Uniformidade dos LPs: O LP-B exibiu desempenho de lasagem superior, mostrando lasagem robusta em baixas energias de bombeio (4 nJ) em comparação ao LP-A, que exigiu energias mais altas e mostrou menor eficiência de lasagem. A citometria de fluxo revelou que o LP-B possuía maior brilho e uma distribuição de tamanho mais estreita, enquanto o LP-A apresentou maior heterogeneidade em tamanho e conteúdo do meio de ganho.
• Modificação de Superfície e Captação: LPs não revestidos mostraram adesão variável; o LP-A aderiu ou foi internalizado pelas células, enquanto o LP-B mostrou mínima adesão. O revestimento com PEI ou lipofectamina melhorou significativamente a associação celular. Os LPs revestidos com PEI mostraram a interação mais forte, com os LPs localizados exclusivamente nas células após a lavagem.
• Eficiência de Separação e Viabilidade Celular: O separador comercial conseguiu separar com sucesso as populações LP+, LP- e LPs isolados. No entanto, observaram-se diferenças dependentes do fabricante: o LP-A apresentou maior eficiência de internalização (19,2% dos eventos foram LP+) em comparação ao LP-B (5,1%). Embora as células associadas ao LP-A tenham mantido taxas de proliferação semelhantes aos controles, as células associadas ao LP-B (tanto a fração LP+ quanto a LP-) exibiram uma redução de ~20% na confluência após 5 dias, sugerindo um potencial efeito inibitório do LP-B no crescimento celular.
• Mecanismo de Interação: A imagem por SEM e TEM revelou mecanismos de interação distintos. Os LPs-A foram totalmente internalizados, com a membrana celular envolvendo completamente a partícula e colocando-a em contato direto com o citosol. Em contraste, os LPs-B foram apenas parcialmente envolvidos, formando uma copa de membrana ao redor da partícula sem contato direto com o citosol.
• Engenharia de Esferoides: A abordagem de separação permitiu a geração de esferoides com proporções definidas de células contendo LP e células livres de LP. Sinais de lasagem foram detectáveis até 300 µm de profundidade dentro dos esferoides, e diâmetros individuais de LPs puderam ser calculados a partir dos espectros de emissão, mesmo em tecidos opticamente densos.

Significância e Alegações
O artigo afirma estabelecer uma base para estudos maiores de engenharia de tecidos, demonstrando que sistemas de citometria de fluxo comercialmente disponíveis podem ser efetivamente adaptados para a purificação e análise de células marcadas com microlasers de grande porte. Os autores sustentam que essa abordagem baseada em espalhamento elimina a necessidade de configurações microfluídicas complexas e customizadas, tornando a marcação óptica de alta resolução e o rastreamento de célula única mais acessíveis.

Além disso, o estudo destaca a importância de caracterizar as propriedades dos LPs (uniformidade, brilho) e a química de superfície, visto que esses fatores influenciam criticamente o desempenho de lasagem, os mecanismos de captação celular e a viabilidade celular. A capacidade de controlar precisamente a densidade de LPs em esferoides abre novos caminhos para o sensoriamento em tecidos profundos e a investigação sistemática das interações célula-partícula. Por fim, os autores sugerem que este arcabouço fornece um modelo robusto para estudar o impacto fisiológico de microplásticos ambientais na saúde humana, dada a capacidade de rastrear e monitorar essas partículas ao nível da célula única.