Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

Résumé technique : Enrichissement de cellules marquées par des microlasers par des systèmes commerciaux de tri cellulaire basés sur la cytométrie en flux

Énoncé du problème
Les microlasers à mode de galerie de l'onde (WGM), généralement des particules de polystyrène (LP) dopées avec un colorant fluorescent, offrent des avantages uniques pour le marquage cellulaire à haute résolution, le suivi de cellules uniques et la biodétection grâce à leur émission brillante et à spectre étroit. Cependant, un goulot d'étranglement critique existe pour l'application de ces outils aux contextes biomédicaux et de l'ingénierie tissulaire : l'incapacité de contrôler de manière reproductible le nombre de LP au sein d'une population cellulaire. Bien que des milliers de cellules marquées puissent être identifiées en culture, garantir une pureté et une composition définies de la population cellulaire sous-jacente concernant la densité de marquage par les LP est essentiel pour des applications avancées. Les méthodes existantes pour trier les cellules basées sur les codes-barres spectraux des LP internalisées reposent sur des configurations microfluidiques sur mesure et des systèmes optiques complexes, qui sont difficiles à construire, à entretenir et à exploiter, limitant ainsi leur accessibilité aux installations de base spécialisées.

Méthodologie
Les auteurs ont développé un flux de travail utilisant des systèmes commerciaux de cytométrie en flux et de tri cellulaire largement disponibles pour purifier des populations cellulaires contenant de grandes LP sans microfluidique personnalisée.

• Sélection et caractérisation des particules : Deux types de LP commerciales (LP-A et LP-B) ont été comparés. Leurs performances de laser, leur brillance de photoluminescence (PL), leur distribution de taille et leur uniformité ont été caractérisés par pompage optique, cytométrie en flux (FSC-A, SSC-A, Red-PL) et microscopie en champ clair.
• Modification de surface : Pour améliorer l'association LP-cellule, les surfaces des LP ont été modifiées avec de la poly(éthylèneimine) (PEI) ou de la lipofectamine afin d'inverser leur charge de surface de négative à positive, favorisant ainsi l'interaction avec la membrane cellulaire chargée négativement.
• Stratégie de tri : Des cellules HEK293T ont été incubées avec des LP et triées à l'aide d'un BD FACSAria Fusion. La stratégie de fenêtrage reposait sur les propriétés de diffusion vers l'avant et latérale (FSC-A, SSC-A) pour distinguer les LP nues, les cellules sans LP (LP-) et les cellules contenant des LP (LP+). La viabilité a été assurée en excluant les événements positifs au DAPI (cellules mortes). La discrimination des singulets a été effectuée pour exclure les agrégats.
• Validation et analyse : Les populations triées ont été validées par cytométrie en flux d'imagerie. L'interaction physique entre les LP et les cellules a été analysée par microscopie électronique à balayage (MEB) et par microscopie électronique en transmission (MET) pour déterminer l'internalisation par rapport à l'attachement de surface.
• Application en ingénierie tissulaire : Les cellules LP+ et LP- triées ont été mélangées à des ratios définis et ensemencées dans des plaques à faible adhérence pour former des sphéroïdes multicellulaires. Ces sphéroïdes ont été scannés à l'aide d'un microscope confocal hyperspectral pour détecter les signaux de laser et calculer les diamètres des LP à partir des spectres d'émission.

Résultats clés

• Performance et uniformité des LP : La LP-B a présenté une performance de laser supérieure, montrant un laser robuste à de faibles énergies de pompage (4 nJ) par rapport à la LP-A, qui nécessitait des énergies plus élevées et présentait une efficacité de laser plus faible. La cytométrie en flux a révélé que la LP-B avait une brillance plus élevée et une distribution de taille plus étroite, tandis que la LP-A présentait une plus grande hétérogénéité de taille et de contenu en milieu de gain.
• Modification de surface et captation : Les LP non revêtues présentały une attache variable ; la LP-A s'attachait ou était internalisée par les cellules, tandis que la LP-B montrait une attache minimale. Le revêtement avec de la PEI ou de la lipofectamine a considérablement amélioré l'association cellulaire. Les LP revêtues de PEI ont montré l'interaction la plus forte, les LP étant localisées exclusivement sur les cellules après lavage.
• Efficacité du tri et viabilité cellulaire : Le triur commercial a réussi à séparer les populations LP+, LP- et les LP nues. Cependant, des différences dépendantes du fabricant ont été observées : la LP-A présentait une efficacité d'internalisation plus élevée (19,2 % des événements étaient LP+) par rapport à la LP-B (5,1 %). Alors que les cellules associées à la LP-A maintenaient des taux de prolifération similaires aux contrôles, les cellules associées à la LP-B (fractions LP+ et LP-) présentaient une réduction d'environ 20 % de la confluence après 5 jours, suggérant un potentiel effet inhibiteur de la LP-B sur la croissance cellulaire.
• Mécanisme d'interaction : L'imagerie MEB et MET a révélé des mécanismes d'interaction distincts. Les LP-A ont été entièrement internalisées, la membrane cellulaire enveloppant complètement la particule et la plaçant en contact direct avec le cytosol. En revanche, les LP-B n'étaient que partiellement englobées, formant une coupe membranaire autour de la particule sans contact direct avec le cytosol.
• Ingénierie de sphéroïdes : L'approche de tri a permis de générer des sphéroïdes avec des ratios définis de cellules contenant des LP et de cellules sans LP. Les signaux de laser étaient détectables jusqu'à 300 µm de profondeur dans les sphéroïdes, et les diamètres individuels des LP pouvaient être calculés à partir des spectres d'émission, même dans un tissu optiquement dense.

Signification et revendications
L'article affirme établir une base pour des études plus larges en ingénierie tissulaire en démontant que les systèmes de cytométrie en flux commercialement disponibles peuvent être efficacement adaptés pour la purification et l'analyse de cellules marquées par de grands microlasers. Les auteurs soutiennent que cette approche basée sur la diffusion élimine le besoin de configurations microfluidiques complexes et sur mesure, rendant le marquage optique à haute résolution et le suivi de cellules uniques plus accessibles.

De plus, l'étude souligne l'importance de la caractérisation des propriétés des LP (uniformité, brillance) et de la chimie de surface, car ces facteurs influencent de manière critique la performance du laser, la captation cellulaire et la viabilité cellulaire. La capacité de contrôler précisément la densité des LP au sein des sphéroïdes ouvre de nouvelles voies pour la détection en tissus profonds et l'étude systématique des interactions cellule-particule. Enfin, les auteurs suggèrent que ce cadre fournit un modèle robuste pour étudier l'impact physiologique des microplastiques environnementaux sur la santé humaine, compte tenu de la capacité de suivre et de surveiller ces particules au niveau de la cellule unique.