Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

तकनीकी सारांश: वाणिज्यिक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित सेल सॉर्टिंग सिस्टम द्वारा माइक्रोलैसर-लेबल वाले कोशिकाओं का संवर्धन

समस्या विवरण
व्हिस्परिंग-गैलरी मोड (WGM) माइक्रोलैसर, जो आमतौर पर फ्लोरोसेंट डाई से युक्त पॉलिस्टायरीन कण (LPs) होते हैं, अपने चमकीले और स्पेक्ट्रली संकीर्ण उत्सर्जन के कारण उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेलुलर टैगिंग, सिंगल-सेल ट्रैकिंग और बायोसेन्सिंग के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं। हालांकि, बायोमेडिकल और ऊतक इंजीनियरिंग (टिश्यू इंजीनियरिंग) संदर्भों में इन्हें लागू करने में एक महत्वपूर्ण बाधा मौजूद है: कोशिका आबादी के भीतर LPs की संख्या पर पुनरुत्पादक रूप से नियंत्रण करने में असमर्थता। जबकि कल्चर में हजारों लेबल वाली कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है, उन्नत अनुप्रयोगों के लिए अंतर्निहित कोशिका आबादी की शुद्धता और संरचना को LP लेबलिंग घनत्व के संबंध में परिभाषित करना आवश्यक है। स्पेक्ट्रल बारकोड के आधार पर कोशिकाओं को छाँटने के लिए मौजूदा विधियाँ कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप और जटिल ऑप्टिकल सिस्टम पर निर्भर करती हैं, जिन्हें बनाना, बनाए रखना और संचालित करना कठिन है, जिससे वे केवल विशिष्ट कोर सुविधाओं तक ही सीमित रह जाती हैं।

कार्यप्रणाली (मेथोडोलॉजी)
लेखकों ने कस्टम माइक्रोफ्लुइडिक्स के बिना बड़े LPs वाली कोशिका आबादी को शुद्ध करने के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध वाणिज्यिक फ्लो साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए एक वर्कफ़्लो विकसित किया।

• कण चयन और लक्षण वर्णन: दो प्रकार के वाणिज्यिक LPs (LP-A और LP-B) की तुलना की गई। उनके लेसिंग प्रदर्शन, फोटोल्यूमिनेसेंस (PL) चमक, आकार वितरण और एकरूपता का ऑप्टिकल पंपिंग, फ्लो साइटोमेट्री (FSC-A, SSC-A, Red-PL) और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लक्षण वर्णन किया गया।
• सतह संशोधन (सरफेस मॉडिफिकेशन): LP-कोशिका जुड़ाव को बढ़ाने के लिए, LP की सतह को पॉली(एथिलीनइमाइन) (PEI) या लिपॉफेक्टमाइन के साथ संशोधित किया गया ताकि उनकी सतह के आवेश को नकारात्मक से सकारात्मक में बदला जा सके, जिससे ऋणात्मक आवेश वाली कोशिका झिल्ली के साथ संपर्क को बढ़ावा मिले।
• सॉर्टिंग रणनीति: HEK293T कोशिकाओं को LPs के साथ इनक्यूबेट किया गया और BD FACSAria का उपयोग करके सॉर्ट किया गया। गेटिंग रणनीति का मुख्य आधार फॉरवर्ड- और साइड-स्कैटरिंग गुणों (FSC-A, SSC-A) पर निर्भर था ताकि खाली LPs, LP-रहित कोशिकाएं (LP-), और LP-युक्त कोशिकाओं (LP+) के बीच अंतर किया जा सके। जीवित रहने की दर सुनिश्चित करने के लिए DAPI-पॉजिटिव इवेंट्स (मृत कोशिकाओं) को बाहर रखा गया। एग्रीगेट्स को बाहर करने के लिए सिंगलेट भेदभाव (डिस्क्रिमिनेशन) किया गया।
• वैधीकरण और विश्लेषण: सॉर्ट की गई आबादी का इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके सत्यापन किया गया। LPs और कोशिकाओं के बीच भौतिक संपर्क का विश्लेषण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) के माध्यम से किया गया ताकि आंतरिककरण (इंटरनलाइजेशन) बनाम सतह जुड़ाव को निर्धारित किया जा सके।
• ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोग: सॉर्ट की गई LP+ और LP- कोशिकाओं को परिभाषित अनुपातों में मिलाया गया और मल्टी-सेलुलर स्फेरॉइड्स बनाने के लिए अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों में सीड किया गया। इन स्फेरॉइड्स को लेसिंग सिग्नल का पता लगाने और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आधार पर व्यक्तिगत LP व्यास की गणना करने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्कैन किया गया।

प्रमुख परिणाम

• LP प्रदर्शन और एकरूपता: LP-B ने बेहतर लेसिंग प्रदर्शन प्रदर्शित किया, जिसमें LP-A की तुलना में कम पंप ऊर्जा (4 nJ) पर भी मजबूत लेसिंग देखी गई, जिसे उच्च ऊर्जा की आवश्यकता थी और जिसमें कम लेसिंग दक्षता दिखाई दी। फ्लो साइटोमेट्री ने खुलासा किया कि LP-B में उच्च चमक और संकीर्ण आकार वितरण था, जबकि LP-A ने आकार और गेन मीडियम सामग्री में व्यापक विषमता दिखाई।
• सतह संशोधन और अपटेक: बिना कोटिंग वाले LPs का जुड़ाव परिवर्तनशील था; LP-A कोशिकाओं से जुड़ गया या उन्हें आत्मसात (इंटरनलाइज) कर लिया, जबकि LP-B ने न्यूनतम जुड़ाव दिखाया। PEI या लिपॉफेक्टमाइन के साथ कोटिंग करने से कोशिका जुड़ाव में काफी सुधार हुआ। PEI-कोटिंग वाले LPs ने सबसे मजबूत संपर्क दिखाया, जिसमें धोने के बाद LPs विशेष रूप से कोशिकाओं पर स्थित थे।
• सॉर्टिंग दक्षता और कोशिका व्यवहार्यता: वाणिज्यिक सॉर्टर ने सफलतापूर्वक LP+, LP-, और खाली LP आबादी को अलग किया। हालांकि, निर्माता-निर्भर अंतर देखे गए: LP-A में उच्च इंटरनलाइजेशन दक्षता (19.2% इवेंट्स LP+ थे) देखी गई, जबकि LP-B (LP+ और LP- दोनों अंश) की तुलना में यह कम (5.1%) थी। जबकि LP-A से जुड़ी कोशिकाओं ने नियंत्रण के समान प्रसार दर बनाए रखी, LP-B (दोनों LP+ और LP- अंश) से जुड़ी कोशिकाओं में 5 दिनों के बाद कॉनफ्लुएंसी में ~20% की कमी देखी गई, जो कोशिका वृद्धि पर LP-B के संभावित निरोधात्मक प्रभाव का सुझाव देती है।
• अंतःक्रिया का तंत्र: SEM और TEM इमेजिंग ने विशिष्ट अंतःक्रिया तंत्रों का खुलासा किया। LP-A पूरी तरह से आत्मसात (इंटरनलाइज) हो गए थे, जिसमें कोशिका झिल्ली ने कण को पूरी तरह से घेर लिया था और उसे साइटोसोल के सीधे संपर्क में ला दिया था। इसके विपरीत, LP-B केवल आंशिक रूप से घिरे हुए थे, जिन्होंने कण के चारों ओर एक मेम्ब्रेन कप बनाया था लेकिन साइटोसोल के साथ सीधा संपर्क नहीं बनाया था।
• स्फेरॉइड इंजीनियरिंग: सॉorting दृष्टिकोण ने LP-युक्त और LP-मुक्त कोशिकाओं के परिभाषित अनुपातों के साथ स्फेरॉइड्स उत्पन्न करने में सक्षम बनाया। ऑप्टिकली घने ऊतकों में भी, 300 µm गहराई तक लेसिंग सिग्नल का पता लगाया जा सकता था, और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से व्यक्तिगत LP व्यास की गणना की जा सकती थी।

महत्व और दावे
यह शोध पत्र यह दावा करते हुए कि वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फ्लो साइटोमेट्री सिस्टम का प्रभावी ढंग से उपयोग बड़े माइक्रोलैसरों से लेबल की गई कोशिकाओं के शुद्धिकरण और विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, बड़े ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययनों के लिए एक आधार स्थापित करता है। लेखक तर्क देते हैं कि यह स्कैटर-आधारित दृष्टिकोण कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल टैगिंग और सिंगल-सेल ट्रैकिंग अधिक सुलभ हो जाती है।

इसके अलावा, अध्ययन LP गुणों (एकरूपता, चमक) और सतह रसायन विज्ञान के लक्षण वर्णन के महत्व पर प्रकाश डालता है, क्योंकि ये कारक लेसिंग प्रदर्शन, कोशिकीय अपटेक तंत्र और कोशिका व्यवहार्यता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं। स्फेरॉइड्स के भीतर LPs के घनत्व को सटीक रूप से नियंत्रित करने की क्षमता गहरे-ऊतक संवेदन (डीप-टिश्यू सेंसिंग) और कोशिका-कण अंतःक्रियाओं के व्यवस्थित अध्ययन के लिए नए मार्ग खोलती है। अंततः, लेखक सुझाव देते हैं कि यह ढांचा मानव स्वास्थ्य पर पर्यावरणीय माइक्रोप्लास्टिक्स के शारीरिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल प्रदान करता है, क्योंकि इसमें इन कणों को सिंगल-सेल स्तर पर ट्रैक और मॉनिटर करने की क्षमता है।