Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

في أعماق عالم البيولوجيا الصناعية، توجد مجموعة من العمال المجهريين الذين يزدهرون حيث قد تهلك معظم أشكال الحياة فوراً. هؤلاء هم محبات الحرارة الشديدة (extreme thermophiles)، وهي بكتيريا تنمو بشكل أفضل في درجات حرارة تقترب من درجة غليان الماء. ومن بينها نوع موهوب بشكل خاص يسمى Anaerocellum bescii. هذه البكتيريا هي قوة طبيعية، قادرة على تفكيك ألياف النباتات الصلبة مثل الخشب والقش إلى سكريات بسيطة يمكن تحويلها إلى وقود ومواد كيميائية. ولأنها تستطيع القيام بهذا العمل في حرارة عالية، فإنها تقدم ميزة فريدة للتصنيع: فالحرارة العالية تبقي الملوثات غير المرغوب فيها بعيدة وتسرع التفاعلات الكيميائية. ومع ذلك، لتحويل هذه الموهبة الطبيعية إلى مصنع موثوق، يحتاج العلماء إلى إعادة كتابة التعليمات الداخلية للبكتيريا، أو ما يعرف بالجينوم. وحتى الآن، كان القيام بذلك في مثل هذا الكائن المحب للحرارة يشبه محاولة إجراء جراحة دقيقة باستخدام مطرقة ثقيلة — عملية بطيئة، وخرقاء، وعرضة لإتلاف الآلات الدقيقة للخلية.

لسنوات، كافح الباحثون لتعديل جينات A. bescii لأن الأدوات التي يستخدمونها في البكتيريا الأكثر برودة وشيوعاً ببساطة تذوب أو تتوقف عن العمل في درجات الحرارة الملتهبة التي يتطلبها هذا الكائن. تضمنت الطريقة القياسية عملية مضنية متعددة الخطوات لتبديل قطع الحمض النووي (DNA)، والتي غالباً ما كانت تترك وراءها ندوباً جينية غير مرغوب فيها أو تسبب عدم استقرار في البكتيريا. كان المجتمع العلمي بحاجة إلى نهج جديد، نهج يمكنه العمل بفعالية في الحرارة. وفي دراسة حديثة، نجح فريق من جامعة برينستون في بناء أول نظام دقيق لتعديل الجينات لهذا النوع من البكتيريا المتطرفة. لقد حققوا ذلك من خلال استعارة أداة جزيئية من ميكروب آخر محب للحرارة، وتكييفها لتعمل عند 75 درجة مئوية، واستخدامها لإجراء قطع نظيف ومحدد في الحمض النووي لـ A. bescii.

لجأ الباحثون إلى بروتين يسمى Cas9، والذي يعمل مثل مقص جزيئي يمكن برمجته للعثور على تسلسل محدد من الحمض النووي وقصه. النسخة الشائعة من هذا البروتين، المستخدمة في العديد من المختبرات، مستمدة من بكتيريا تعيش في درجات حرارة الجسم الطبيعية، ومن شأنها أن تتفكك فوراً في الحرارة العالية لـ A. bescii. ولحل هذه المشكلة، اختار الفريق نسخة من Cas9 من بكتيريا Geobacillus stearothermophilus، وهي بكتيريا تعيش طبيعياً في الينابيع الساخنة. هذه النسخة المستقرة حرارياً، والمعروفة باسم GeoCas9، صُممت لتبقى نشطة حتى في درجات الحرارة العالية حيث تنمو A. bescii. قام الفريق ببناء قطعة صغيرة دائرية من الحمض النووي، وهي تعمل أساساً كمركبة توصيل، تحمل تعليمات هذه المقصات المقاومة للحرارة ودليلاً يوجهها بدقة إلى مكان القطع. أدخلوا هذه المركبة إلى البكتيريا ثم خفضوا درجة حرارة المزرعة قليلاً إلى 65 درجة مئوية لفترة كافية للسماح بعملية القطع، قبل العودة إلى بيئة البكتيريا الحارة المعتادة.

بمجرد أن قامت المقصات بإجراء قطعها، تدخلت آليات الإصلاح الخاصة بالبكتيريا لإصلاح الكسر. قدم الباحثون نموذجاً لهذا الإصلاح، موجهين الخلية لإزالة جين معين واستبداله بتسلسل قصير وغير ضار من الحمض النووي يعمل كعلامة. باستخدام هذه الطريقة، نجحوا في إزالة جينين مختلفين من جينوم البكتيريا. الجين الأول الذي حذفه كانوا مسؤولين عن إنتاج اللاكتات، وهو منتج ثانوي غير مرغوب فيه. عندما اختفى هذا الجين، توقفت البكتيريا عن إنتاج اللاكتات وبدأت بدلاً من ذلك في إنتاج المزيد من الأسيتات، وهو مادة كيميائية مفيدة. أما الجين الثاني الذي أزالوه، فقد كان ضرورياً لصنع اليوراسيل، وهو أحد اللبنات الأساسية للحمض النووي. بدون هذا الجين، لم تعد البخلية قادرة على النمو إلا إذا أضاف العلماء اليوراسيل إلى غذائها. وقد أكد ذلك أن التعديل كان دقيقاً وأن البكتيريا كانت تتصرف تماماً كما توقعت التعليمات المفقودة.

ثم أظهر الفريق أن هذا النظام الجديد يمكن استخدامه بشكل متكرر. لقد أخذوا البكتيريا التي فقدت بالفعل جين صنع اليوراسيل واستخدموا نفس أداة التعديل لإزالة جين صنع اللاكتات أيضاً. أثبت هذا أن العملية يمكن تراكمها (stacking)، مما يسمح للعلماء بإجراء تغييرات متعددة على نفس الكائن دون الفوضى الجينية التي كانت تعيب الطرق القديمة. ولإظهار الإمكانات الكاملة لنظامهم، استهدفوا جيناً ثالثاً مرتبطاً بصنع التريبتوفان، وهو حمض أميني. ومن خلال حذف الجينات المسؤولة عن إنزيم تخليق التريبتوفان، خلقوا سلالة لا يمكنها البقاء على قيد الحياة دون إضافة التريبتوفان إلى طعامها. وقد خلق هذا طريقة جديدة للاختيار في التجارب الناجحة: فإذا نمت البكتيريا بدون إضافة التريبتوفان، فهذا يعني أنها قد استقبلت بنجاح قطعة جديدة من الحمض النووي التي استعادت قدرتها على صنعه.

أخيراً، استخدم الباحثون طريقة الاختيار الجديدة هذه لاختبار ما إذا كانت البكتيريا يمكنها الاحتفاظ بقطعة جديدة من الحمض النووي واستخدامها جنباً إلى جنب مع جين تقريري (reporter gene). لقد أعطوا البكتيريا المعتمدة على التريبتوفان مركبة دائرية من الحمض النووي تحتوي على جينات التريبتوفان المفقودة بالإضافة إلى جين لإنزيم مستقر حرارياً يتوهج عند اختباره. أظهرت البكتيريا التي استقبلت هذه المركبة أنها قادرة على النمو بدون إضافة التريلفان، وعند اختبارها، أظهرت نشاطاً قوياً من الإنزيم الجديد. أكد هذا أن نظام التعديل الجديد لا يسمح فقط بإزالة الجينات غير المرغوب فيها، بل يوفر أيضاً طريقة قوية لإضافة وظائف جديدة إلى البكتيريا. ومن خلال وضع طريقة موثوقة ومقاومة للحرارة لتعديل الجينوم، فتح الباحثون الباب أمام هندسة A. bescii بشكل أكثر كفاءة، مما قد يسرع من تطوير المصانع البيولوجية التي يمكنها تحويل النفايات النباتية إلى منتجات قيمة.