Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

Nel profondo del mondo della biologia industriale, esiste un gruppo di operai microscopici che prosperano dove la maggior parte della vita morirebbe istantaneamente. Questi sono gli estremofili termofili, batteri che crescono meglio a temperature vicine al punto di ebollizione dell'acqua. Tra di loro c'è una specie particolarmente dotata chiamata Anaerocellum bescii. Questo batterio è una vera centrale energetica naturale, capace di scomporre le dure fibre vegetali come il legno e la paglia in zuccheri semplici che possono essere trasformati in combustibili e prodotti chimici. Poiché può svolgere questo lavoro ad alto calore, offre un vantaggio unico per la produzione: l'alta temperatura tiene lontani i contaminanti indesiderati e accelera le reazioni chimiche. Tuttavia, per trasformare questo talento naturale in una fabbrica affidabile, gli scienziati devono riscrivere le istruzioni interne del batterio, ovvero il suo genoma. Finora, farlo in un organismo che ama il calore è stato come tentare di eseguire una delicata chirurgia con un maglio: lento, goffo e incline a danneggiare la delicata meccanica della cellula.

Per anni, i ricercatori hanno faticato a modificare i geni di A. bescii perché gli strumenti che utilizzano nei batteri più comuni e a temperature più basse si sciolgono o smettono di funzionare alle temperature roventi richieste da questo organismo. Il metodo standard prevedeva un processo laborioso e multi-fase di scambio di pezzi di DNA, che spesso lasciava dietro di sé cicatrici genetiche indesiderate o rendeva i batteri instabili. La comunità scientifica aveva bisogno di un nuovo approccio, uno che potesse operare efficacemente nel calore. In uno studio recente, un team della Princeton University ha costruito con successo il primo sistema di editing genico preciso per questo estremo batterio. Ci sono riusciti prendendo in prestito uno strumento molecolare da un altro microbo amante del calore, adattandolo per lavorare a 75 gradi Celsius e usandolo per effettuare tagli puliti e specifici nel DNA di A. bescii.

I ricercatori si sono rivolti a una proteina chiamata Cas9, che agisce come un paio di forbici molecolari che possono essere programmate per trovare e tagliare una specifica sequenza di DNA. La versione comune di questa proteina, utilizzata in molti laboratori, è prodotta da batteri che vivono a una temperatura corporea normale e si disintegrerebbe istantaneamente nel calore di A. bescii. Per risolvere il problema, il team ha selezionato una versione di Cas9 da Geobacillus stearothermophilus, un batterio che vive naturalmente nelle sorgenti termali. Questa versione termostabile, nota come GeoCas9, è stata progettata per rimanere attiva anche alle alte temperature in cui cresce A. bescii. Il team ha costruito un piccolo pezzo di DNA circolare, essenzialmente un veicolo di consegna, che trasportava le istruzioni per queste forbici resistenti al calore e una guida che diceva esattamente dove tagliare. Hanno introdotto questo veicolo nei batteri e poi hanno abbassato leggermente la temperatura della coltura a 65 gradi Celsius solo il tempo necessario affinché avvenisse il taglio, prima di riportare i batteri al loro normale ambiente caldo.

Una volta che le forbici hanno effettuato il loro taglio, i meccanismi di riparazione dei batteri sono intervenuti per sistemare la rottura. I ricercatori hanno fornito un modello per questa riparazione, istruendo la cellula a rimuovere un gene specifico e a sostituirlo con una sequenza di DNA breve e innocua che funge da marcatore. Usando questo metodo, sono riusciti a rimuovere due diversi geni dal genoma del batterio. Il primo gene che hanno eliminato era responsabile della produzione di lattato, un prodotto di scarto. Quando questo gene è stato rimosso, i batteri hanno smesso di produrre lattato e hanno invece prodotto più acetato, un prodotto chimico utile. Il secondo gene che hanno rimosso era essenziale per la produzione di uracile, un mattone fondamentale del DNA. Senza questo gene, i batteri non potevano più crescere a meno che gli scienziati non aggiungessero uracile al loro nutrimento. Ciò ha confermato che l'editing era preciso e che i batteri si comportavano esattamente come previsto dalle istruzioni mancanti.

Il team ha poi dimostrato che questo nuovo sistema poteva essere utilizzato ripetutamente. Hanno preso i batteri che avevano già perso il gene per la produzione di uracile e hanno usato lo stesso strumento di editing per rimuovere anche il gene per la produzione di lattato. Questo ha dimostrato che il processo poteva essere cumulativo, permettendo agli scienziati di apportare molteplici modifiche allo stesso organismo senza il caos genetico che spesso affliggeva i vecchi metodi. Per mostrare il pieno potenziale del loro sistema, hanno mirato a un terzo gene coinvolto nella produzione di triptofano, un amminoacido. Eliminando i geni per la triptofano sintasi, hanno creato un ceppo che non poteva sopravvivere senza triptofano nel proprio nutrimento. Questo ha creato un nuovo modo per selezionare gli esperimenti di successo: se i batteri crescevano senza l'aggiunta di triptofano, significava che avevano assorbito con successo un nuovo pezzo di DNA che ripristinava la loro capacità di produrlo.

Infine, i ricercatori hanno utilizzato questo nuovo metodo di selezione per testare se i batteri potessero trattenere e utilizzare un nuovo pezzo di DNA contenente un gene reporter. Hanno fornito ai batteri dipendenti dal triptofano un veicolo di DNA circolare che conteneva i geni mancanti del triptofano insieme a un gene per un enzima termostabile che brilla quando testato. I batteri che avevano assorbito questo veicolo sono stati in grado di crescere senza l'aggiunta di triptofano e, quando testati, hanno mostrato una forte attività dall'enzima introdotto. Ciò ha confermato che il nuovo sistema di editing non solo permette la rimozione di geni indesiderati, ma fornisce anche un modo robusto per aggiungere nuove funzioni al batterio. Stabilendo un metodo affidabile e tollerante al calore per l'editing del genoma, i ricercatori hanno aperto la porta all'ingegnerizzazione più efficiente di A. bescii, accelerando potenzialmente lo sviluppo di fabbriche biologiche capaci di convertire gli scarti vegetali in prodotti di valore.