Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

En lo profundo del mundo de la biología industrial, existe un grupo de trabajadores microscópicos que prosperan donde la mayoría de la vida perecería instantáneamente. Estos son los termófilos extremos, bacterias que crecen mejor a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua. Entre ellos se encuentra una especie particularmente talentosa llamada Anaerocellum bescii. Esta bacteria es una potencia natural, capaz de descomponer fibras vegetales resistentes como la madera y la paja en azúcares simples que pueden convertirse en combustibles y productos químicos. Debido a que puede realizar este trabajo a altas temperaturas, ofrece una ventaja única para la fabricación: el calor elevado mantiene alejados a los contaminantes no deseados y acelera las reacciones químicas. Sin embargo, para convertir este talento natural en una fábrica confiable, los científicos necesitan reescribir las instrucciones internas de la bacteria, o genoma. Hasta ahora, editar este organismo amante del calor ha sido como intentar realizar una cirugía delicada con un mazo: lento, torpe y propenso a dañar la delicada maquinaria de la célula.

Durante años, los investigadores han luchado por editar los genes de A. bescii porque las herramientas que utilizan en bacterias más comunes y frescas simplemente se derriten o dejan de funcionar a las temperaturas abrasadoras que este organismo requiere. El método estándar consistía en un tedioso proceso de varios pasos para intercambiar piezas de ADN, lo que a menudo dejaba cicatrices genéticas no deseadas o causaba que las bacterias se volvieran inestables. La comunidad científica necesitaba un nuevo enfoque, uno que pudiera operar eficazmente en el calor. En un estudio reciente, un equipo de la Universidad de Princeton logró construir el primer sistema de edición genética preciso para esta bacteria extrema. Lo lograron tomando prestada una herramienta molecular de otro microbio amante del calor, adaptándola para que funcionara a 75 grados Celsius y utilizándola para realizar cortes limpios y específicos en el ADN de A. bescii.

Los investigadores recurrieron a una proteína llamada Cas9, que actúa como un par de tijeras moleculares que pueden programarse para encontrar y cortar una secuencia específica de ADN. La versión común de esta proteína, utilizada en muchos laboratorios, es producida por bacterias que viven a la temperatura corporal normal y se desmoronaría instantáneamente con el calor de A. bescii. Para resolver esto, el equipo seleccionó una versión de Cas9 de Geobacillus stearothermophilus, una bacteria que vive naturalmente en aguas termales. Esta versión termoestable, conocida como GeoCas9, fue diseñada para permanecer activa incluso en las altas temperaturas donde crece A. bescii. El equipo construyó una pequeña pieza circular de ADN, esencialmente un vehículo de entrega, que transportaba las instrucciones para estas tijeras resistentes al calor y una guía que le decía exactamente dónde cortar. Introdujeron este vehículo en las bacterias y luego bajaron ligeramente la temperatura del cultivo a 65 grados Celsius solo el tiempo suficiente para permitir que ocurriera el corte, antes de devolver las bacterias a su entorno caluroso normal.

Una vez que las tijeras realizaron su corte, los mecanismos de reparación propios de las bacterias entraron en acción para reparar la ruptura. Los investigadores proporcionaron una plantilla para esta reparación, instruyendo a la célula para eliminar un gen específico y reemplazarlo con una secuencia de ADN corta e inofensiva que sirviera como marcador. Utilizando este método, lograron eliminar con éxito dos genes diferentes del genoma de la bacteria. El primer gen que eliminaron era responsable de producir lactato, un producto de desecho. Cuando este gen desapareció, las bacterias dejaron de producir lactato y, en su lugar, produjeron más acetato, un producto químico útil. El segundo gen que eliminaron era esencial para la fabricación de uracilo, un componente de construcción del ADN. Sin este gen, las bacterias ya no podían crecer a menos que los científicos añadieran uracilo a su alimento. Esto confirmó que la edición era precisa y que las bacterias se comportaban exactamente como lo predecían las instrucciones faltantes.

El equipo demostró entonces que este nuevo sistema podía utilizarse repetidamente. Tomaron las bacterias que ya habían perdido el gen de fabricación de uracilo y utilizaron la misma herramienta de edición para eliminar también el gen de fabricación de lactato. Esto demostró que el proceso podía acumularse, permitiendo a los científicos realizar múltiples cambios en el mismo organismo sin el caos genético que a menudo plagaba a los métodos más antiguos. Para mostrar todo el potencial de su sistema, se dirigieron a un tercer gen involucrado en la fabricación de triptófano, un aminoácido. Al eliminar los genes para la triptófano sintasa, crearon una cepa que no podía sobrevivir sin triptófano en su alimento. Esto creó una nueva forma de seleccionar experimentos exitosos: si las bacterias crecían sin triptófano añadido, significaba que habían incorporado con éxito una nueva pieza de ADN que restauraba su capacidad para fabricarlo.

Finalmente, los investigadores utilizaron este nuevo método de selección para probar si las bacterias podían retener y utilizar una nueva pieza de ADN que transportaba un gen reportero. Entregaron a las bacterias dependientes de triptófano un vehículo de ADN circular que contenía los genes de triptófano faltantes junto con un gen para una enzima termoestable que brilla cuando se prueba. Las bacterias que incorporaron este vehículo fueron capaces de crecer sin triptófano añadido y, al ser probadas, mostraron una fuerte actividad de la nueva enzima. Esto confirmó que el nuevo sistema de edición no solo permite la eliminación de genes no deseados, sino que también proporciona una forma robusta de añadir nuevas funciones a la bacteria. Al establecer un método fiable y tolerante al calor para editar el genoma, los investigadores han abierto la puerta para la ingeniería de A. bescii de manera más eficiente, acelerando potencialmente el desarrollo de fábricas biológicas que puedan convertir los desechos vegetales en productos valiosos.