Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

Tief in der Welt der industriellen Biologie existiert eine Gruppe mikroskopisch kleiner Arbeiter, die dort gedeihen, wo die meisten Lebensformen sofort sterben würden. Dies sind extremophile Thermophile, Bakterien, die am besten bei Temperaturen nahe dem Siedepunkt von Wasser wachsen. Unter ihnen befindet sich eine besonders talentierte Spezies namens Anaerocellum bescii. Dieses Bakterium ist ein natürliches Kraftpaket, das in der Lage ist, zähe Pflanzenfasern wie Holz und Stroh in einfache Zucker zu zerlegen, die in Kraftstoffe und Chemikalien umgewandelt werden können. Da es diese Arbeit bei hoher Hitze verrichten kann, bietet es einen einzigartigen Vorteil für die Herstellung: Die hohe Temperatur hält unerwünschte Verunreinigungen fern und beschleunigt chemische Reaktionen. Um dieses natürliche Talent jedoch in eine zuverlässige Fabrik zu verwandeln, müssen Wissenschaftler die internen Anweisungen, oder das Genom, des Bakteriums umschreiben. Bis jetzt war das Editieren eines solchen hitzeliebenden Organismus wie der Versuch, eine präzise Operation mit einem Vorschlaghammer durchzuführen – langsam, klobig und anfällig dafür, die empfindliche Maschinerie der Zelle zu beschädigen.

Jahrelang hatten Forscher Schwierigkeiten, die Gene von A. bescii zu editieren, da die Werkzeuge, die sie in kühleren, gängigeren Bakterien verwenden, bei den brennend heißen Temperaturen, die dieser Organismus benötigt, einfach schmelzen oder aufhören zu funktionieren. Die Standardmethode bestand aus einem mühsamen, mehrstufigen Prozess des Austauschens von DNA-Stücken, der oft unerwünschte genetische Narben hinterließ oder dazu führte, dass die Bakterien instabil wurden. Die wissenschaftliche Gemeinschaft benötigte einen neuen Ansatz, einen, der bei der Hitze effektiv arbeiten konnte. In einer kürzlich durchgeführten Studie gelang es einem Team der Princeton University, das erste präzise Gen-Editierungssystem für diesen extremen Bakterienstamm zu bauen. Sie erreichten dies, indem sie ein molekulares Werkzeug von einem anderen hitzeliebenden Mikroben entliehen, es an das Arbeiten bei 75 Grad Celsius anpassten und es nutzten, um saubere, spezifische Schnitte im Genom von A. bescii vorzunehmen.

Die Forscher wandten sich an ein Protein namens Cas9, das wie eine molekulare Schere fungiert, die so programmiert werden kann, dass sie eine spezifische DNA-Sequenz findet und schneidet. Die gängige Version dieses Proteins, die in vielen Laboren verwendet wird, stammt von Bakterien, die bei normaler Körpertemperatur leben, und würde in der Hitze von A. bescii sofort auseinanderfallen. Um dies zu lösen, wählte das Team eine Version von Cas9 aus Geobacillus stearothermophilus, einem Bakterium, das natürlich in heißen Quellen lebt. Diese hitzebeständige Version, bekannt als GeoCas9, wurde entwickelt, um selbst bei den hohen Temperaturen, bei denen A. bescii wächst, aktiv zu bleiben. Das Team konstruierte ein kleines, kreisförmiges Stück DNA, im Wesentlichen ein Transportmittel, das die Anweisungen für diese hitzeresistente Schere und einen Leitfaden trug, der ihr genau sagte, wo sie schneiden sollte. Sie führten dieses Transportmittel in die Bakterien ein und senkten dann die Kulturtemperatur kurzzeitig auf 65 Grad Celsius ab, gerade lang genug, um den Schnitt zu ermöglichen, bevor sie die Bakterien wieder ihrer normalen heißen Umgebung aussetzten.

Sobald die Schere ihren Schnitt gemacht hatte, griffen die eigenen Reparaturmechanismen der Bakterien ein, um den Bruch zu flicken. Die Forscher stellten eine Vorlage für diese Reparatur bereit und wiesen die Zelle an, ein spezifisches Gen zu entfernen und es durch eine harmlose, kurze DNA-Sequenz zu ersetzen, die als Marker diente. Mit dieser Methode gelang es ihnen, zwei verschiedene Gene aus dem Genom des Bakteriums zu entfernen. Das erste Gen, das sie löschten, war für die Produktion von Lactat verantwortlich, einem Abfallprodukt. Als dieses Gen fehlte, produzierten die Bakterien kein Lactat mehr, sondern staten stattdessen mehr Acetat, einen nützlichen Stoff. Das zweite Gen, das sie entfernten, war essenziell für die Herstellung von Uracil, einem Baustein der DNA. Ohne dieses Gen konnten die Bakterien nicht wachsen, es sei denn, die Wissenschaftler fügten Uracil zu ihrer Nahrung hinzu. Dies bestätigte, dass das Editieren präzise war und dass sich die Bakterien genau so verhielten, wie es durch die fehlenden Anweisungen vorhergesagt worden war.

Das Team demonstrierte dann, dass dieses neue System wiederholt verwendet werden konnte. Sie nahmen die Bakterien, die bereits das Uracil-bildende Gen verloren hatten, und nutzten dasselbe Editierungswerkzeug, um auch das Lactat-bildende Gen zu entfernen. Dies bewies, dass der Prozess gestapelt werden konnte, was es Wissenschaftlern ermöglichte, mehrere Änderungen am selben Organismus vorzunehmen, ohne das genetische Chaos, das ältere Methoden oft plagte. Um das volle Potenzial ihres Systems zu zeigen, nahmen sie sich ein drittes Gen vor, das an der Herstellung von Tryptophan, einer Aminosäure, beteiligt ist. Durch das Löschen der Gene für die Tryptophan-Synthase schufen sie einen Stamm, der ohne Tryptophan in ihrer Nahrung nicht überleben konnte. Dies schuf eine neue Möglichkeit, um erfolgreiche Experimente zu selektieren: Wenn die Bakterien ohne hinzugefügtes Tryptophan wuchsen, bedeutete dies, dass sie erfolgreich ein neues Stück DNA aufgenommen hatten, das ihre Fähigkeit zur Herstellung von Tryptophan wiederherstellte.

Schließlich nutzten die Forscher diese neue Selektionsmethode, um zu testen, ob die Bakterien in der Lage sind, ein neues Stück DNA aufzunehmen und zu nutzen, das ein Reportergen trägt. Sie gaben den Tryptophan-abhängigen Bakterien ein kreisförmiges DNA-Transportmittel, das neben den fehlenden Tryptophan-Genen auch ein Gen für ein hitzebeständiges Enzym enthielt, das leuchtet, wenn es getestet wird. Die Bakterien, die dieses Transportmittel aufgenommen hatten, waren in der Lage, ohne hinzugefügtes Tryptophan zu wachsen, und zeigten bei Tests eine starke Aktivität des neuen Enzyms. Dies bestätigte, dass das neue Editierungssystem nicht nur das Entfernen unerwünschter Gene ermöglicht, sondern auch einen robusten Weg bietet, neue Funktionen in das Bakterium einzuführen. Durch die Etablierung einer zuverlässigen, hitzetoleranten Methode zur Editierung des Genoms haben die Forscher die Tür zur effizienteren Gestaltung von A. bescii geöffnet und damit potenziell die Entwicklung biologischer Fabriken beschleunigt, die Pflanzenabfälle in wertvolle Produkte umwandeln können.