Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

Diep in de wereld van de industriële biologie bestaat een groep microscopische arbeiders die gedijen waar de meeste levensvormen onmiddellijk zouden sterven. Dit zijn extreme thermofielen, bacteriën die het beste groeien bij temperaturen nabij het kookpunt van water. Onder hen bevindt zich een bijzonder getalenteerde soort genaamd Anaerocellum bescii. Deze bacterie is een natuurlijk krachtpatser, in staat om taai plantaardig materiaal zoals hout en stro af te breken tot eenvoudige suikers die kunnen worden omgezet in brandstoffen en chemicaliën. Omdat deze het werk bij hoge hitte kan doen, biedt het een uniek voordeel voor de productie: de hoge temperatuur houdt ongewenste contaminanten weg en versnelt chemische reacties. Echter, om dit natuurlijke talent om te vormen tot een betrouwbare fabriek, moeten wetenschappers de interne instructies van de bacterie, of het genoom, herschrijven. Tot nu toe was het bewerken van een dergelijke hitte-minnende organisme als het uitvoeren van een delicate operatie met een mokerhamer — traag, onhandig en gevoelig voor het beschadigen van de delicate machinerie van de cel.

Jarenlang hebben onderzoekers gestreden om de genen van A. bescii te bewerken, omdat de instrumenten die ze gebruiken in koelere, meer voorkomende bacteriën simpelweg smelten of stoppen met werken bij de verschroeiende temperaturen die deze organisme vereist. De standaardmethode bestond uit een tijdrovend, meerstaps proces van het verwisselen van DNA-stukjes, wat vaak ongewenste genetische littekens achterliet of ervoor zorgde dat de bacteriën instabiel werden. De wetenschappelijke gemeenschap had een nieuwe aanpak nodig, een die effectief kon opereren in de hitte. In een recente studie is een team van de Princeton University erin geslaagd het eerste precieze gen-bewerkingssysteem voor deze extreme bacterie te bouwen. Ze bereikten dit door een moleculair instrument te lenen van een andere hitte-minnende microbe, het aan te passen om te werken bij 75 graden Celsius, en het te gebruiken om schone, specifieke knip in het DNA van A. bescii te maken.

De onderzoekers wenden zich tot een eiwit genaamd Cas9, dat fungeert als een soort moleculaire schaar die geprogrammeerd kan worden om een specifieke DNA-sequentie op te zoeken en door te knippen. De gangbare versie van dit eiwit, gebruikt in veel laboratoria, wordt gemaakt door bacteriën die leven bij een normale lichaamstemperatuur en zou onmiddellijk uit elkaar vallen in de hitte van A. bescii. Om dit op te lossen, selecteerde het team een versie van Cas9 van Geobacillus stearothermophilus, een bacterie die van nature leeft in hete bronnen. Deze hittebestendige versie, bekend als GeoCas9, werd ontworpen om actief te blijven, zelfs bij de hoge temperaturen waar A. bescii groeit. Het team construeerde een klein, circulair stuk DNA, in essentie een voertuig voor levering, dat de instructies voor deze hittebestendige schaar en een gids met zich meedroeg die de schaar vertelde precies waar te knippen. Ze introduceerden dit voertuig in de bacteriën en verlaagden vervolgens de cultuurtemperatuur iets naar 65 graden Celsius, net lang genoeg om de knip te laten plaatsvinden, voordat ze de bacteriën terugbrachten naar hun normale hete omgeving.

Zodra de scharen hun knip maakten, kwamen de eigen herstelmechanismen van de bacteriën in actie om de breuk te herstellen. De onderzoekers voorzagen de cel van een sjabloon voor dit herstel, waarbij de cel de instructie kreeg om een specif씩 gene te verwijderen en te vervangen door een onschadelijke, korte DNA-sequentie die als marker diende. Met deze methode slaagden ze erin om twee verschillende genen uit het genoom van de bacterie te verwijderen. Het eerste gen dat ze verwijderden, was verantwoordelijk voor de productie van lactaat, een afvalproduct. Toen dit gen verdwenen was, stopten de bacteriën met het produceren van lactaat en produceerden ze in plaats daarvan meer acetaat, een nuttig chemisch bestanddeel. Het tweede gen dat ze verwijderden, was essentieel voor het maken van uracil, een bouwsteen van DNA. Zonder dit gen konden de bacteriën niet groeien, tenzij de wetenschappers uracil aan hun voedsel toevoegden. Dit bevestigde dat de bewerking precies was en dat de bacteriën zich exact gedroegen zoals voorspeld door de ontbrekende instructies.

Het team demonstreerde vervolgens dat dit nieuwe systeem herhaaldelijk kon worden gebruikt. Ze namen de bacteriën die al het uracil-makende gen hadden verloren en gebruikten hetzelfde bewerkingsinstrument om ook het lactaat-makende gen te verwijderen. Dit bewees dat het proces gestapeld kon worden, waardoor wetenschappers meerdere wijzigingen aan hetzelfde organisme konden aanbrengen zonder de genetische chaos die vaak de oudere methoden teisterde. Om het volledige potentieel van hun systeem aan te tonen, richtten ze zich op een derde gen dat betrokken is bij de productie van tryptofaan, een aminozuur. Door de genen voor tryptofaan-synthase te verwijderen, creëerden ze een stam die niet kon overleven zonder tryptofaan in hun voedsel. Dit creëerde een nieuwe manier om succesvolle experimenten te selecteren: als de bacteriën groeiden zonder toegevoegd tryptofaan, betekende dit dat ze succesvol een nieuw stuk DNA hadden opgenomen dat hun vermogen om het te maken herstelde.

Ten slotte gebruikten de onderzoekers deze nieuwe selectiemethode om te testen of de bacteriën in staat waren om een nieuw stuk DNA met een reportergen vast te houden en te gebruiken. Ze gaven de tryptofaan-afhankelijke bacteriën een circulair DNA-voertuig dat de ontbrekende tryptofaan-genen bevat samen met een gen voor een hittebestendig enzym dat gloeit wanneer het getest wordt. De bacteriën die dit voertuig hadden opgenomen, waren in staat om te groeien zonder toegevoegd tryptofaan en vertoonden, bij testen, een sterke activiteit van het nieuwe enzym. Dit bevestigde dat het nieuwe bewerkingssysteem niet alleen toestaat om ongewenste genen te verwijderen, maar ook een robuuste manier biedt om nieuwe functies aan de bacterie toe te voegen. Door een betrouwbare, hittebestendige methode voor het bewerken van het genoom te vestigen, hebben de onderzoekers de deur geopend naar het efficiënter modificeren van *A. bescii, wat potentieel de ontwikkeling van biologische fabrieken die plantaardig afval kunnen omzetten in waardevolle producten kan versnellen.