Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

Nas profundezas do mundo da biologia industrial, existe um grupo de trabalhadores microscópicos que prosperam onde a maioria das formas de vida morreria instantaneamente. Estes são os termófilos extremos, bactérias que crescem melhor em temperaturas próximas ao ponto de ebulição da água. Entre eles está uma espécie particularmente talentosa chamada Anaerocellum bescii. Esta bactéria é uma potência natural, capaz de decompor fibras vegetais resistentes, como madeira e palha, em açúcares simples que podem ser transformados em combustíveis e produtos químicos. Como ela pode realizar este trabalho sob calor intenso, oferece uma vantagem única para a manufatura: a alta temperatura mantém longe contaminantes indesejados e acelera as reações químicas. No entanto, para transformar esse talento natural em uma fábrica confiável, os cientistas precisam reescrever as instruções internas da bactéria, ou seja, o seu genoma. Até agora, fazer isso em um organismo que ama o calor era como tentar realizar uma cirurgia delicada com uma marreta — lento, desajeitado e propenso a danificar o delicado maquinário da célula.

Durante anos, pesquisadores lutaram para editar os genes de A. bescii porque as ferramentas que utilizam em bactérias mais comuns e frias simplesmente derretem ou param de funcionar nas temperaturas escaldantes que este organismo exige. O método padrão envolvia um processo tedioso de várias etapas para trocar pedaços de DNA, o que frequentemente deixava cicatrizes genéticas indesejadas ou fazia com que as bactérias se tornassem instáveis. A comunidade científica precisava de uma nova abordagem, uma que pudesse operar efetivamente no calor. Em um estudo recente, uma equipe da Universidade de Princeton construiu com sucesso o primeiro sistema de edição genética preciso para esta bactéria extrema. Eles conseguiram isso ao pegar emprestado uma ferramenta molecular de outro micróbio que ama o calor, adaptando-a para funcionar a 75 graus Celsius e usando-a para fazer cortes limpos e específicos no DNA de A. bescii.

Os pesquisadores recorreram a uma proteína chamada Cas9, que atua como uma tesoura molecular que pode ser programada para encontrar e cortar uma sequência específica de DNA. A versão comum desta proteína, usada em muitos laboratórios, é feita por bactérias que vivem na temperatura corporal normal e se desintegraria instantaneamente no calor de A. bescii. Para resolver isso, a equipe selecionou uma versão da Cas9 de Geobacillus stearothermophilus, uma bactéria que vive naturalmente em fontes termais. Esta versão termoestável, conhecida como GeoCas9, foi projetada para permanecer ativa mesmo nas altas temperaturas onde o A. bescii cresce. A equipe construiu um pequeno pedaço circular de DNA, essencialmente um veículo de entrega, que carregava as instruções para estas tesouras resistentes ao calor e um guia que dizia exatamente onde cortar. Eles introduziram este veículo nas bactérias e, em seguida, baixaram ligeiramente a temperatura da cultura para 65 graus Celsius apenas o tempo suficiente para permitir que o corte acontecesse, antes de retornar as bactérias ao seu ambiente quente normal.

Assim que as tesouras fizeram o seu corte, os próprios mecanismos de reparo das bactérias entraram em ação para consertar a quebra. Os pesquisadores forneceram um modelo para este reparo, instruindo a célula a remover um gene específico e substituí-lo por uma sequência de DNA curta e inofensiva que servia como um marcador. Usando este método, eles removeram com sucesso dois genes diferentes do genoma da bactéria. O primeiro gene que deletaram era responsável pela produção de lactato, um subproduto de descarte. Quando este gene foi removido, as bactérias pararam de produzir lactato e passaram a produzir mais acetato, um produto químico útil. O segundo gene que removeram era essencial para a fabricação de uracila, um bloco de construção do DNA. Sem este gene, as bactérias não poderiam mais crescer, a menos que os cientistas adicionassem uracila ao seu alimento. Isso confirmou que a edição foi precisa e que as bactérias estavam se comportando exatamente como previsto pelas instruções ausentes.

A equipe demonstrou então que este novo sistema poderia ser usado repetidamente. Eles pegaram as bactérias que já haviam perdido o gene de fabricação de uracila e usaram a mesma ferramenta de edição para remover também o gene de fabricação de lactato. Isso provou que o processo poderia ser empilhado, permitindo que os cientistas fizessem múltiplas alterações no mesmo organismo sem o caos genético que frequentemente assolava os métodos mais antigos. Para demonstrar o pleno potencial do seu sistema, eles focaram em um terceiro gene envolvido na produção de triptofano, um aminoácido. Ao deletar os genes para a triptofano sintase, criaram uma linhagem que não poderia sobreviver sem triptofano em seu alimento. Isso criou uma nova maneira de selecionar experimentos bem-sucedidos: se as bactérias crescessem sem a adição de triptofano, significava que haviam absorvido com sucesso um novo pedaço de DNA que restaurava sua capacidade de produzi-lo.

Finalmente, os pesquisadores usaram este novo método de seleção para testar se as bactérias poderiam manter e usar um novo pedaço de DNA contendo um gene repórter. Eles deram às bactérias dependentes de triptofano um veículo de DNA circular que continha os genes de triptofano ausentes, juntamente com um gene para uma enzima termoestável que brilha quando testada. As bactérias que absorveram este veículo foram capazes de crescer sem a adição de triptofano e, quando testadas, mostraram forte atividade da nova enzima. Isso confirmou que o novo sistema de edição não apenas permite a remoção de genes indesejados, mas também fornece uma maneira robusta de adicionar novas funções à bactéria. Ao estabelecer um método confiável e tolerante ao calor para editar o genoma, os pesquisadores abriram as portas para a engenharia de A. bescii de forma mais eficiente, potencialmente acelerando o desenvolvimento de fábricas biológicas que podem converter resíduos vegetais em produtos valiosos.