Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

산업 생물학의 세계 깊은 곳에는 대부분의 생명체가 즉시 사멸할 법한 환경에서도 번성하는 미세한 일꾼 집단이 존재합니다. 이들은 바로 극한의 호열성 미생물로, 물의 끓는점에 가까운 온도에서 가장 잘 자라는 박테리아들입니다. 이들 중에는 특히 재능 있는 종인 *아나에로셀룸 베시(Anaerocellum bescii)*가 있습니다. 이 박테리아는 천연의 강력한 동력원으로, 나무나 짚과 같은 단단한 식물 섬유를 연료와 화학 물질로 전환할 수 있는 단순한 당으로 분해할 수 있습니다. 고온에서 이 작업을 수행할 수 있기 때문에, 이는 제조 공정에서 독특한 이점을 제공합니다. 높은 온도는 원치 않는 오염 물질을 차단하고 화학 반응을 가속화하기 때문입니다. 그러나 이 자연적인 재능을 신뢰할 수 있는 공장으로 바꾸기 위해서는, 과학자들이 이 박테리아의 내부 지침, 즉 게놈(genome)을 다시 써야 합니다. 지금까지 이와 같은 열을 좋아하는 유기체의 유전자를 편집하는 것은, 마치 정교한 기계를 다루기 위해 정밀한 수술 도구 대신 거대한 망치를 사용하는 것과 같았습니다. 느리고 서툴렀으며, 세포의 섬세한 기계 장치에 손상을 입히기 쉬웠기 때문입니다.

수년 동안 연구자들은 A. bescii의 유전자를 편집하는 데 어려움을 겪어 왔습니다. 그들이 사용하는 도구들이 더 차갑고 흔한 박테리아에서 유래한 것들이라, 이 유기체가 요구하는 뜨거운 온도에서는 녹아버리거나 작동을 멈추기 때문입니다. 기존 방식은 DNA 조각들을 교체하는 지루하고 여러 단계에 걸친 과정을 포함했는데, 이는 종종 원치 않는 유전적 흉터를 남기거나 박테리아를 불안정하게 만들었습니다. 과학계는 열 속에서도 효과적으로 작동할 수 있는 새로운 접근 방식, 즉 열에 견딜 수 있는 방식을 필요로 했습니다. 최근 프린스턴 대학교의 한 연구팀은 이 극한의 박테리아를 위한 최초의 정밀 유전자 편집 시스템을 구축하는 데 성공했습니다. 그들은 다른 열을 좋아하는 미생물로부터 분자 도구를 빌려와 이를 섭씨 75도에서 작동하도록 적응시킴으로써 이를 달성했으며, 이를 통해 A. bescii의 DNA에 깨끗하고 특정한 절단을 가했습니다.

연구진은 특정 DNA 서열을 찾아내어 자를 수 있도록 프로그래밍된 분자 가위 역할을 하는 단백질인 Cas9에 주목했습니다. 실험실에서 흔히 사용되는 일반적인 버전의 이 단백질은 체온 정도의 정상적인 온도에서 사는 박테리아에 의해 만들어지며, A. bescii의 열기 속에서는 즉시 분해되어 버릴 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해 연구팀은 온천에 서식하는 박테리아인 *게오바실러스 스테아로테르모필루스(Geobacillus stearothermophilus)*에서 유래한 Cas9 버전을 선택했습니다. '지오캐스9(GeoCas9)'으로 알려진 이 열 안정성 버전은 A. bescii가 자라는 고온에서도 활성을 유지하도록 설계되었습니다. 연구팀은 이 열 저항성 가위의 지침과 정확히 어디를 자를지 알려주는 가이드를 담은 작은 원형 DNA, 즉 전달 차량을 제작했습니다. 이 차량을 박테리아에 도입한 후, 절단이 일어날 수 있도록 잠시 동안만 배양 온도를 섭씨 65도로 약간 낮춘 뒤, 다시 박테리아의 정상적인 뜨거운 환경으로 되돌렸습니다.

가위가 절단을 마치면, 박테리아 자체의 복구 메커니즘이 작동하여 끊어진 부분을 고칩니다. 연구진은 특정 유전자를 제거하고 이를 무해하고 짧은 DNA 서열(마커 역할)로 교체하도록 지시하는 템플릿을 제공했습니다. 이 방법을 사용하여 그들은 박테리아 게놈에서 두 가지 서로 다른 유전자를 성공적으로 제거했습니다. 첫 번째로 삭제한 유전자는 젖산을 생성하는 책임이 있는 유전자였습니다. 이 유전자가 사라지자 박테리아는 젖산을 만드는 대신 유용한 화학 물질인 아세테이트를 더 많이 생산했습니다. 두로 삭제한 두 번째 유전자는 우라실(DNA의 구성 성분)을 만드는 데 필수적인 것이었습니다. 이 유전자가 없으면 박테리아는 과학자들이 먹이에 우라실을 추가하지 않는 한 더 이상 성장할 수 없습니다. 이는 편집이 정밀하게 이루어졌으며, 박테리아가 누락된 지침에 따라 정확하게 행동하고 있음을 확인시켜 주었습니다.

연구팀은 이 새로운 시스템을 반복해서 사용할 수 있음을 입증했습니다. 그들은 이미 우라실 생성 유전자를 잃은 박테리아를 가져와 동일한 편집 도구를 사용하여 젖산 생성 유전자를 제거했습니다. 이는 이 과정이 중첩될 수 있음을 증명하며, 이전 방식들이 흔히 겪었던 유전적 혼란 없이 동일한 유기체에 여러 변화를 가할 수 있음을 보여주었습니다. 시스템의 전체 잠재력을 보여주기 위해, 그들은 트립토판(아미노산의 일종) 생성에 관여하는 세 번째 유전자를 표적으로 삼았습니다. 트립토판 합성효소 유전자를 삭제함으로써, 그들은 트립토판이 먹이에 공급되지 않으면 생존할 수 없는 균주를 만들어냈습니다. 이는 실험의 성공 여부를 선택할 수 있는 새로운 방법을 만들어냈습니다. 즉, 박테리아가 추가된 트립토판 없이도 자란다면, 그것은 그들이 능력을 회복시키는 새로운 DNA 조각을 성공적으로 받아들였다는 것을 의미합니다.

마지막으로, 연구진은 이 새로운 선택법을 사용하여 박테리아가 리포터 유전자를 운반하는 새로운 DNA 조각을 보유하고 사용할 수 있는지 테스트했습니다. 그들은 트립토판 의존적 박테리아에게 결핍된 트립토판 유전자와 테스트 시 빛을 내는 열 안정성 효소 유전자를 포함한 원형 DNA 차량을 제공했습니다. 이 차량을 받아들인 박테리아는 트립토판 없이도 자랄 수 있었으며, 테스트 결과 새로운 효소의 강한 활성을 보였습니다. 이는 새로운 편집 시스템이 원치 않는 유전자를 제거할 뿐만 아니라, 박테키아에 새로운 기능을 추가하는 강력한 방법까지 제공한다는 것을 확인시켜 주었습니다. 열에 견디는 신뢰할 수 있는 게놈 편집 방법을 확립함으로써, 연구진은 식물 폐기물을 가치 있는 제품으로 전환하는 생물학적 공장의 개발을 가속화할 수 있는 문을 열었습니다.