Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii
本研究报告了在极端微生物 *Anaerocellum bescii* 中首次成功实现耐热型 CRISPR-Cas9 系统，从而实现了高效的基因缺失，并构建了一个色氨酸营养缺陷型菌株，以改进载体的选择与维持。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
在工业生物学的深处，存在着一群在大多数生命无法生存的高温环境中茁壮成长的微型工人。这些是极端嗜热菌，它们在接近水沸点的温度下生长得最好。在这些细菌中，有一种特别有天赋的物种叫做 Anaerocellum bescii。这种细菌是一个天然的动力源，能够将木材和秸秆等坚韧的植物纤维分解成简单的糖类，进而转化为燃料和化学品。由于它能在高温下进行这项工作，这为制造业提供了一个独特的优势：高温可以阻隔不必要的污染物并加速化学反应。然而，要将这种天然天赋转化为可靠的工厂，科学家需要重写这种细菌的内部指令，即基因组。直到现在，在这种嗜热生物中进行基因编辑就像是用大锤进行精细的外科手术一样——缓慢、笨拙，且容易损坏细胞内精密的机制。
多年来，研究人员一直难以编辑 A. bescii 的基因，因为他们用于常温常见细菌的工具会在这种生物所需的灼热温度下熔化或停止工作。标准方法涉及一个繁琐的多步骤过程，通过交换 DNA 片段来进行操作，但这往往会留下多余的遗传疤痕，或导致细菌变得不稳定。科学界需要一种新方法，一种能在热量中有效运作的方法。在最近的一项研究中，普林斯顿大学的一个团队成功构建了这种极端嗜热细菌的首个精准基因编辑系统。他们通过借鉴另一种嗜热微生物的分子工具，将其改造为能在 75 摄氏度下工作，并利用它对 A. bescii 的 DNA 进行干净、精确的切割。
研究人员转向了一种被称为 Cas9 的蛋白质，它就像一对分子剪刀，可以被编程去寻找并切割特定的 DNA 序列。这种蛋白质的常见版本是由生活在正常体温下的细菌制造的，在 A. bescii 的高温下会立即分解。为了解决这个问题，该团队选择了来自 Geobacillus stearothermophilus（一种天然生活在热泉中的细菌）的一种 Cas9 版本。这种被称为 GeoCas9 的耐热版本被设计为即使在 A. bescii 生长的极高温度下也能保持活性。团队构建了一个小的环状 DNA 片段，本质上是一个运载工具，它携带了这对耐热剪刀的指令以及告诉它精确切割位置的引导序列。他们将这个载体引入细菌，然后将培养物的温度稍微降低到 65 摄氏度，时间仅够完成切割过程，之后再将细菌恢复到正常的炎热环境中。
一旦剪刀完成了切割，细菌自身的修复机制就会启动以修复断裂。研究人员提供了一个模板来进行这种修复，指示细胞移除一个特定的基因，并用一段无害的短 DNA 序列作为标记进行替换。使用这种方法，他们成功地从细菌的基因组中删除了两个不同的基因。他们删除的第一个基因负责产生乳酸，这是一种代谢废物。当这个基因消失后，细菌停止产生乳酸，转而产生更多的乙酸盐，这是一种有用的化学物质。他们删除的第二个基因对于合成尿嘧啶（DNA 的组成部分）至关重要。如果没有这个基因，除非科学家在食物中添加尿嘧啶，否则细菌将无法生长。这证实了编辑是精准的，并且细菌的行为完全符合缺失指令后的预期。
随后，团队证明了这种新系统可以重复使用。他们利用已经失去了尿嘧啶合成基因的细菌，再次使用相同的编辑工具去移除产生乳酸的基因。这证明了该过程是可以叠加的，允许科学家对同一个生物体进行多次修改，而不会出现以往方法中常见的遗传混乱。为了展示该系统的全部潜力，他们瞄准了第三个涉及合成色氨酸（一种氨基酸）的基因。通过删除色氨酸合酶的基因，他们创造出了一种在没有添加色氨酸的情况下无法存活的菌株。这创造了一种筛选成功实验的新方法：如果细菌在没有添加色氨酸的情况下生长，则意味着它们已经成功吸收了一段新的 DNA，从而恢复了合成能力。
最后，研究人员利用这种新的筛选方法来测试细菌是否能够保留并使用一段带有报告基因的新 DNA。他们给那些依赖色氨酸生存的细菌提供了一个环状 DNA 载体，其中包含了缺失的色氨酸基因以及一个在测试时会发光的耐热酶基因。那些吸收了该载体的细菌能够在没有添加色氨酸的情况下生长，并且在测试时显示出该新酶的强活性。这证实了新的编辑系统不仅允许移除不需要的基因，还提供了一种向细菌添加新功能稳健的方法。通过建立一种可靠、耐热的基因组编辑方法，研究人员为更高效地工程化 A. bescii 开辟了大门，有望加速开发能将植物废弃物转化为价值产品的生物工厂。
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