Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

産業生物学の世界の奥深くには、ほとんどの生命が即座に死滅してしまうような環境で繁栄する、微小な労働者たちのグループが存在します。これらは極限好熱菌であり、水の沸点に近い温度で最もよく成長する細菌です。その中でも、Anaerocellum bescii と呼ばれる特に才能豊かな種があります。この細菌は天然の動力源であり、木材や藁のような硬い植物繊維を、燃料や化学物質に転換できる単純な糖へと分解することができます。高温下でこの作業を行うことができるため、製造において独自の利点を提供します。すなわち、高温によって不要な汚染物質を遠ざけ、化学反応を加速させることができるのです。しかし、この自然の才能を信頼できる工場へと変えるためには、科学者たちはこの細菌の内部指令、すなわちゲノムを書き換える必要があります。これまで、このような熱を好む生物に対してこれを行うことは、繊細な手術をスレッジハンマー（大槌）で行おうとするようなものでした。それは遅く、不器用で、細胞の繊細な機構を損傷しやすいものでした。

長年、研究者たちは A. bescii の遺伝子を編集することに苦労してきました。なぜなら、彼らが使用する、より低温で一般的な細菌のためのツールは、この生物が必要とする灼熱の温度では溶けてしまうか、あるいは動作を停止してしまうからです。標準的な手法は、DNAの断片を入れ替えるという退屈で多段階のプロセスを含むものでしたが、それはしばしば不要な遺伝的な傷跡を残したり、細菌を不安定にさせたりしました。科学界は、熱の中でも効果的に機能する新しいアプローチ、すなわち、より優れた手法を必要としていました。最近の研究で、プリンストン大学のチームは、この極限好熱菌のための最初の精密な遺伝子編集システムを構築することに成功しました。彼らは、別の好熱性の微生物から分子ツールを借り、それを摂氏75度で機能するように適応させ、それを用いて A. bescii のDNAにクリーンで特定の切断を加えることで、これを達成しました。

研究者たちは、プログラムによって特定のDNA配列を見つけ出して切断することができる、分子のハサミとして機能する Cas9 というタンパク質に着目しました。多くのラボで使用されている一般的なバージョンのこのタンパク質は、通常の体温で生きる細菌によって作られたものであり、A. bescii の熱の中では即座に崩壊してしまいます。この問題を解決するために、チームは Geobacillus stearothermophilus という、天然の温泉に生息する細菌から Cas10 の一種を選びました。この熱安定性のあるバージョンの Cas9 は、GeoCas9 として知られ、A. bescii が生育する高温下でも活性を維持するように設計されています。チームは、この熱に強いハサミの指示と、どこを切るかを伝えるガイドを運ぶ、いわば配送車両である小さな環状DNAを構築しました。彼らはこの車両を細菌に導入し、その後、切断が行われる間だけ培養温度を摂氏65度までわずかに下げ、それから細菌を通常の熱い環境に戻しました。

ハサミが切断を行うと、細菌自身の修復メカニズムが働き、その断絶を修復します。研究者たちは、特定の遺伝子を除去し、それを無害で短いDNA配列（マーカーとして機能するもの）に置き換えるよう指示するテンプレートを提供しました。この手法を用いて、彼らは細菌のゲノムから2つの異なる遺伝子を正常に除去することに成功しました。最初に削除された遺伝子は、乳酸を生成する責任を持つものでした。この遺伝子がなくなると、細菌は乳酸の代わりに、より有用な化学物質である酢酸をより多く生成するようになりました。二番目に削除された遺伝子は、DNAの構成要素であるウラシルを作るために不可欠なものでした。この遺伝子がないと、科学者が食べ物にウラシルを添加しない限り、細菌は成長できなくなります。これにより、編集が精密であり、かつ、細菌が欠落した指示通りに振る舞っていることが確認されました。

チームは、この新しいシステムを繰り返し使用できることを実証しました。彼らは、すでにウラシル生成遺伝子を失った細菌を取り出し、同じ編集ツールを使用して、乳酸生成遺伝子をも除去しました。これは、プロセスを積み重ねることが可能であることを証明しており、古い手法がしばしば引き起こした遺伝的な混乱を招くことなく、同一の生物に対して複数の変更を加えることができることを示しています。このシステムの全貌を示すために、彼らはトリプトファン（アミノ酸の一種）の合成に関与する第三の遺伝子を標的にしました。トリプトファン合成酵素の遺伝子を削除することで、彼らはトリプトファンが食べ物の中に存在しなければ生存できない株を作り出しました。これにより、実験の成功を選択するための新しい方法が生まれました。つまり、もし細菌が添加されたトリプトファンなしで成長した場合、それは彼らが、その能力を回復させる新しいDNAの断片を取り込むことに成功したことを意味します。

最後に、研究者たちは、この新しい選択方法を使用して、細菌がリポーター遺伝子を運ぶ新しいDNA断片を保持し、利用できるかどうかをテストしました。彼らは、欠落しているトリプトファン遺伝子と、テスト時に光る熱安定性酵素の遺伝子を含む環状DNA車両を、トリプトファン依存性の細菌に与えました。この車両を取り込んだ細菌は、トリプトファンなしで成長することができ、テストを行った際、新しい酵素の強い活性を示しました。これは、新しい編集システムが、不要な遺伝子の除去を可能にするだけでなく、細菌に新しい機能を付加するための堅牢な方法をも提供することを裏付けました。信頼性の高い、耐熱性のあるゲノム編集方法を確立したことにより、研究者たちは A. bescii をより効率的にエンジニアリングすることを可能にし、植物廃棄物を価値ある製品へと変換する生物学的工場の開発を加速させる扉を開いたのです。