Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

Au plus profond du monde de la biologie industrielle, il existe un groupe d'ouvriers microscopiques qui prospèrent là où la plupart des formes de vie périraient instantanément. Ce sont des thermophiles extrêmes, des bactéries qui se développent de manière optimale à des températures proches de l'ébullition de l'eau. Parmi elles se trouve une espèce particulièrement talentueuse appelée Anaerocellum bescii. Cette bactérie est une véritable centrale de puissance naturelle, capable de décomposer les fibres végétales coriaces comme le bois et la paille en sucres simples qui peuvent être transformés en carburants et en produits chimiques. Parce qu'elle peut accomplir ce travail à haute température, elle offre un avantage unique pour la fabrication : la chaleur élevée éloigne les contaminants indésirables et accélère les réactions chimiques. Cependant, pour transformer ce talent naturel en une usine fiable, les scientifiques doivent réécrire les instructions internes de la bactérie, ou son génome. Jusqu'à présent, éditer ce genre d'organisme aimant la chaleur revenait à essayer de pratiquer une chirurgie délicate avec une masse, de manière lente, maladroite et susceptible d'endommager la machinerie délicate de la cellule.

Pendant des années, les chercheurs ont lutté pour éditer les gènes d'A. bescii car les outils qu'ils utilisent dans des bactéries plus communes et vivant à des températures plus fraîches fondent ou cessent de fonctionner aux températures brûlantes requises par cet organisme. La méthode standard impliquait un processus fastidieux et multi-étapes de remplacement de fragments d'ADN, ce qui laissait souvent derrière lui des cicatrices génétiques indésirables ou rendait les bactéries instables. La communauté scientifique avait besoin d'une nouvelle approche, capable d'opérer efficacement dans la chaleur. Dans une étude récente, une équipe de l'Université de Princeton a réussi à construire le premier système d'édition génique précis pour cette bactérie extrême. Ils y sont parvenus en empruntant un outil moléculaire à un autre microbe aimant la chaleur, en l'adaptant pour fonctionner à 75 degrés Celsius, et en l'utilisant pour effectuer des coupes propres et spécifiques dans l'ADN d'A. bescii.

Les chercheurs se sont tournés vers une protéine appelée Cas9, qui agit comme une paire de ciseaux moléculaires pouvant être programmée pour trouver et couper une séquence spécifique d'ADN. La version courante de cette protéine, utilisée dans de nombreux laboratoires, est issue de bactéries qui vivent à une température corporelle normale et s'effondrerait instantanément dans la chaleur d'A. bescii. Pour résoudre ce problème, l'équipe a sélectionné une version de Cas9 provenant de Geobacillus stearothermophilus, une bactérie qui vit naturellement dans les sources chaudes. Cette version résistante à la chaleur, connue sous le nom de GeoCas9, a été conçue pour rester active même aux hautes températures où A. bescii se développe. L'équipe a construit un petit morceau d'ADN circulaire, essentiellement un véhicule de livraison, qui transportait les instructions de ces ciseaux résistants à la chaleur ainsi qu'un guide indiquant exactement où couper. Ils ont introduit ce véhicule dans les bactéries, puis ont légèrement abaissé la température de la culture à 65 degrés Celsius juste assez longtemps pour permettre la coupe, avant de ramener les bactéries à leur environnement chaud habituel.

Une fois que les ciseaux ont effectué leur coupe, les propres mécanismes de réparation des bactéries se sont activés pour réparer la brèche. Les chercheurs ont fourni un modèle pour cette réparation, ordonnant à la cellule de supprimer un gène spécifique et de le remplacer par une séquence d'ADN courte et inoffensive servant de marqueur. En utilisant cette méthode, ils ont réussi à supprimer deux gènes différents du génome de la bactérie. Le premier gène qu'ils ont supprimé était responsable de la production de lactate, un produit résiduel. Une fois ce gène disparu, les bactéries ont cessé de produire du lactate pour produire davantage d'acétate, un produit chimique utile. Le second gène qu'ils ont supprimé était essentiel à la fabrication de l'uracile, un composant de l'ADN. Sans ce gène, les bactéries ne pouvaient plus croître à moins que les scientifiques n'ajoutent de l'uracile à leur nourriture. Cela a confirmé que l'édition était précise et que les bactéries se comportaient exactement comme prédit par l'absence d'instructions.

L'équipe a ensuite démontré que ce nouveau système pouvait être utilisé de manière répétée. Ils ont pris les bactéries ayant déjà perdu le gène de fabrication de l'uracile et ont utilisé le même outil d'édition pour supprimer également le gène de fabrication du lactate. Cela a prouvé que le processus pouvait être cumulé, permettant aux scientifiques d'apporter plusieurs modifications au même organisme sans le chaos génétique qui frappait souvent les anciennes méthodes. Pour montrer tout le potentiel de leur système, ils ont ciblé un troisième gène impliqué dans la fabrication du tryptophane, un acide aminé. En supprimant les gènes de la tryptophane synthase, ils ont créé une souche incapable de survivre sans l'ajout de tryptophane dans sa nourriture. Cela a créé une nouvelle façon de sélectionner les expériences réussies : si les bactéries poussaient sans ajout de tryptophane, cela signifiait qu'elles avaient bien intégré un nouveau fragment d'ADN restaurant leur capacité à le fabriquer.

Enfin, les chercheurs ont utilisé cette nouvelle méthode de sélection pour tester si les bactéries pouvaient conserver et utiliser un nouveau fragment d'ADN portant un gène rapporteur. Ils ont donné aux bactéries dépendantes du tryptophane un véhicule d'ADN circulaire contenant les gènes manquants du tryptophane ainsi qu'un gène pour une enzyme résistante à la chaleur qui devient fluorescente lors d'un test. Les bactéries qui ont absorbé ce véhicule ont pu croître sans ajout de tryptophane et, lors des tests, ont montré une forte activité de la nouvelle enzyme. Cela a confirmé que le nouveau système d'édition permet non seulement de supprimer des gènes indésirables, mais fournit également un moyen robuste d'ajouter de nouvelles fonctions à la bactérie. En établissant une méthode de modification du génome fiable et tolérante à la chaleur, les chercheurs ont ouvert la voie à une ingénierie plus efficace d'A. bescii, accélérant potentiellement le développement de usines biologiques capables de convertir les déchets végétaux en produits de grande valeur.