Development of a CRISPR-Cas9 genome editing system for the extremely thermophilic bacterium Anaerocellum bescii

औद्योगिक जीव विज्ञान की गहराइयों में, सूक्ष्म श्रमिकों का एक समूह मौजूद है जो वहां फलते-फूलते हैं जहां अधिकांश जीवन तुरंत नष्ट हो जाएगा। ये एक्सट्रीम थर्मोफाइल्स (extreme thermophiles) हैं, ऐसे बैक्टीरिया जो पानी के उबलते बिंदु के करीब के तापमान पर सबसे अच्छी तरह बढ़ते हैं। इनमें एक विशेष रूप से प्रतिभाशाली प्रजाति है जिसे एनारोसेलम बेसी (Anaerocellum bescii) कहा जाता है। यह बैक्टीरिया एक प्राकृतिक पावरहाउस है, जो लकड़ी और भूसे जैसे कठोर पौधों के रेशों को सरल शर्करा में तोड़ने में सक्षम है, जिसे ईंधन और रसायनों में बदला जा सकता है। चूंकि यह इस काम को उच्च ताप पर कर सकता है, इसलिए यह विनिर्माण के लिए एक अनूठा लाभ प्रदान करता है: उच्च तापमान अवांछित संदूषकों को दूर रखता है और रासायनिक प्रतिक्रियाओं को तेज करता है। हालांकि, इस प्राकृतिक प्रतिभा को एक विश्वसनीय कारखाने में बदलने के लिए, वैज्ञानिकों को बैक्टीरिया के आंतरिक निर्देशों, या जीनोम को फिर से लिखने की आवश्यकता है। अब तक, इस तरह के ताप-प्रेमी जीव में ऐसा करना एक नाजुक मशीनरी के साथ हथौड़े से सर्जरी करने जैसा था—धीमा, अनाड़ी और कोशिका की नाजुक मशीनरी को नुकसान पहुँचाने वाला।

वर्षों तक, शोधकर्ताओं ने ए. बेसी के जीन को संपादित करने के लिए संघर्ष किया क्योंकि ठंडे, अधिक सामान्य बैक्टीरिया में उपयोग किए जाने वाले उपकरण या तो पिघल जाते हैं या इस जीव के लिए आवश्यक भीषण तापमान पर काम करना बंद कर देते हैं। मानक विधि में डीएनए के टुकड़ों को बदलने की एक थकाऊ, बहु-चरणीय प्रक्रिया शामिल थी, जो अक्सर पीछे अवांछित आनुवंशिक निशान छोड़ देती थी या बैक्टीरिया को अस्थिर बना देती थी। वैज्ञानिक समुदाय को एक नए दृष्टिकोण की आवश्यकता थी, जो गर्मी में प्रभावी ढंग से काम कर सके। हाल ही में एक अध्ययन में, प्रिंसटन विश्वविद्यालय की एक टीम ने इस चरम बैक्टीरिया के लिए पहला सटीक जीन-संपादन तंत्र बनाने में सफलता प्राप्त की। उन्होंने इसे एक अन्य ताप-प्रेमी सूक्ष्मजीव से एक आणविक उपकरण उधार लेकर हासिल किया, इसे 75 डिग्री सेल्सियस पर काम करने के लिए अनुकूलित किया, और इसका उपयोग ए. बेसी के डीएनए में साफ, विशिष्ट कट लगाने के लिए किया।

शोधकर्ताओं ने Cas9 नामक प्रोटीन की ओर रुख किया, जो आणविक कैंची की तरह कार्य करता है जिसे डीएनए के एक विशिष्ट अनुक्रम को खोजने और काटने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। इस प्रोटीन का सामान्य संस्करण, जो कई प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है, सामान्य शारीरिक तापमान पर रहने वाले बैक्टीरिया द्वारा बनाया जाता है और ए. बेसी की गर्मी में तुरंत बिखर जाएगा। इस समस्या को हल करने के लिए, टीम ने जियोबैसिलस स्टीरोथर्मोफिलस (Geobacillus stearothermophilus) से Cas9 का एक संस्करण चुना, जो स्वाभाविक रूप से गर्म झरनों में रहता है। इस ताप-स्थिर संस्करण को, जिसे GeoCas9 के रूप में जाना जाता है, इस तरह डिजाइन किया गया था कि वह ए. बेसी के उच्च तापमान पर भी सक्रिय रहे। टीम ने डीएनए का एक छोटा, गोलाकार टुकड़ा बनाया, जो अनिवार्य रूप से एक वितरण वाहन (delivery vehicle) था, जिसमें इन ताप-प्रतिरोधी कैंचियों के निर्देश और एक मार्गदर्शक (guide) ले जाया गया था जो इसे बताता था कि ठीक कहाँ काटना है। उन्होंने इस वाहन को बैक्टीरिया में पेश किया और फिर कट लगने देने के लिए कल्चर तापमान को थोड़ा कम करके 65 डिग्री सेल्सियस कर दिया, और फिर बैक्टीरिया को उनके सामान्य गर्म वातावरण में वापस ले आए।

एक बार जब कैंची ने अपना कट लगाया, तो बैक्टीरिया के अपने मरम्मत तंत्र ने टूट को ठीक करने के लिए काम शुरू कर दिया। शोधकर्ताओं ने मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट प्रदान किया, जिसमें कोशिका को एक विशिष्ट जीन को हटाने और उसे डीएनए के एक हानिरहित, छोटे अनुक्रम से बदलने का निर्देश दिया गया जो एक मार्कर के रूप में कार्य करता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, उन्होंने सफलतापूर्वक बैक्टीरिया के जीनोम से दो अलग-अलग जीन हटा दिए। पहला जीन जो हटाया गया था, वह लैक्टेट (lactate) पैदा करने के लिए जिम्मेदार था, जो एक अपशिष्ट उत्पाद है। जब यह जीन चला गया, तो बैक्टीरिया ने लैक्टेट बनाना बंद कर दिया और इसके बजाय अधिक एसीटेट (acetate) का उत्पादन किया, जो एक उपयोगी रसायन है। दूसरा जीन जिसे उन्होंने हटाया था, वह यूरैसिल (uracil) बनाने के लिए आवश्यक था, जो डीएनए का एक निर्माण खंड है। इस जीन के बिना, बैक्टीरिया तब तक नहीं बढ़ सकते थे जब तक कि वैज्ञानिक उनके भोजन में यूरैसिल न मिला दें। इसने पुष्टि की कि संपादन सटीक था और बैक्टीरिया बिल्कुल उसी तरह व्यवहार कर रहे थे जैसा कि गायब निर्देशों द्वारा अनुमान लगाया गया था।

टीम ने फिर प्रदर्शित किया कि इस नए सिस्टम का बार-बार उपयोग किया जा सकता है। उन्होंने उन बैक्टीरिया को लिया जिनमें पहले से ही यूरैसिल बनाने वाला जीन खो गया था और उसी संपादन उपकरण का उपयोग लैक्टेट बनाने वाले जीन को हटाने के लिए किया। इसने सिद्ध किया कि इस प्रक्रिया को 'स्टैक' (stack) किया जा सकता है, जिससे वैज्ञानिकों को पुराने तरीकों से होने वाली आनुवंशिक अराजकता के बिना एक ही जीव में कई परिवर्तन करने की अनुमति मिलती है। अपने सिस्टम की पूरी क्षमता दिखाने के लिए, उन्होंने ट्रिप्टोफैन (tryptophan) में शामिल तीसरे जीन को लक्षित किया, जो एक अमीनो एसिड है। ट्रिप्टोफैन सिंथेज़ के लिए जीन को हटाकर, उन्होंने एक ऐसा स्ट्रेन बनाया जो बिना अतिरिक्त ट्रिप्टोफैन के जीवित नहीं रह सकता था। इसने सफल प्रयोगों के चयन के लिए एक नया तरीका बनाया: यदि बैक्टीरिया बिना अतिरिक्त ट्रिप्टोफैन के बढ़ते हैं, तो इसका मतलब है कि उन्होंने सफलतापूर्वक एक नया डीएनए का टुकड़ा ले लिया है जो उनकी ट्रिप्टोफैन बनाने की क्षमता को बहाल करता है।

अंत में, शोधकर्ताओं ने इस नए चयन पद्धति का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया कि क्या बैक्टीरिया एक नए डीएनए टुकड़े को रख सकते हैं और उसका उपयोग कर सकते हैं जिसमें एक रिपोर्टर जीन हो। उन्होंने ट्रिप्टोफैन-निर्भर बैक्टीरिया को एक गोलाकार डीएनए वाहन दिया जिसमें गायब ट्रिप्टोफैन जीन के साथ-साथ एक जीन भी था जो परीक्षण किए जाने पर चमकता है। जो बैक्टीरिया ने इस वाहन को ग्रहण किया, वे बिना अतिरिक्त ट्रिप्टोफैन के बढ़ने में सक्षम थे और जब परीक्षण किया गया, तो उनमें नए एंजाइम की मजबूत गतिविधि दिखाई दी। इसने पुष्टि की कि नया संपादन तंत्र न केवल अनचाहे जीन को हटाने की अनुमति देता है, बल्कि बैक्टीरिया में नए कार्यों को जोड़ने का एक मजबूत तरीका भी प्रदान करता है। एक विश्वसनीय, ताप-सहनशील संपादन पद्धति स्थापित करके, शोधकर्ताओं ने ए. बेसी को अधिक कुशलता से इंजीनियर करने का मार्ग खोल दिया है, जो संभावित रूप से पौधों के कचरे को मूल्यवान उत्पादों में बदलने वाले जैविक कारखानों के विकास को गति दे सकता है।