Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

على مدى قرون، جاء اللون الأزرق الداكن للدنيم (الجينز) واللون الأحمر النابض بالحياة لبعض الأدوية من جزيئين متميزين: الإنديغو (النيلي) والإنديروبين. الإنديغو هو صبغة المنسوجات الكلاسيكية التي تمنح سراويل الجينز لونها المميز، بينما الإنديروبين هو شقيق بنيوي له، وهو مركب نشط بيولوجياً يوجد في العلاجات العشبية التقليدية، ومعروف بتأثيره على كيفية نمو الخلايا وتواصلها. لفترة طويلة، كان إنتاج هذه المواد يعني الاعتماد على المصانع الكيميائية التي تستخدم مذيبات قاسية وتولد نفايات كبيرة. وفي السنوات الأخيرة، توجه العلماء إلى آلات الطبيعة الخاصة -الميكروبات- لصنع هذه المركبات بطريقة أكثر نظافة. ومن خلال هندسة البكتيريا والخميرة لتعمل كأدوات كيميائية صغيرة، يمكن للباحثين إطعامها مواد أولية بسيطة ومشاهدتها وهي تحول تلك المواد إلى أصباغ قيمة. ويكمن المفتاح في هذا التحول غالباً في نوع محدد من الإنزيمات، وهو أداة بيولوجية تستخدم الأكسجين لتعديل الجزيئات، محولةً لبنة بناء عديمة اللون إلى منتج ملون.

في دراسة جديدة، استكشف باحثون في جامعة "أجو" في كوريا الجنوبية ما إذا كان يمكن تدريب نوع معين من الخميرة، يُعرف باسم Komagataella phaffii، للقيام بهذه المهمة. وبينما استُخدمت البكتيريا لهذا الغرض من قبل، إلا أن الخميرة توفر مزايا مختلفة، مثل القدرة على التعامل مع طي البروتين المعقد والنمو بكثافات عالية جداً في البيئات الصناعية. ركز الفريق على إنزيم يسمى MaFMO، وهو مستمد من بكتيريا تعيش في بيئات غنية بالكبريت. هذا الإنزيم عبارة عن وحدة واحدة قائمة بذاتها يمكنها أخذ جزيء يسمى "إندول"، وباستخدام الأكسجين والطاقة من الخلية، تحويله إلى الوسائط التفاعلية اللازمة لتكوين الإنديغو والإنديروبين. أراد الباحثون معرفة ما إذا كان بإمكانهم بنجاح تثبيت هذا الإنزيم البكتيري داخل جينوم الخميرة، وإذا كان الأمر كذلك، كيف ستؤثر الظروف المختلفة مثل كمية الطعام، وسرعة الخلط، وإضافة مواد كيميائية معينة على الكمية النهائية من الصبغة الزرقاء والحمراء المنتجة.

بدأ الفريق بإدخال جين إنزيم MaFMO في الحمض النووي للخميرة، مما خلق سلالة يمكنها إنتاج الإنزيم عند تغذيتها بالميثانول. وعندما أضافوا الإندول إلى المزرعة، كانت النتيجة فورية ومرئية. فقد تحولت خلايا الخميرة، التي كانت عادة بلون كريمي باهت، إلى لون أزرق مميز، خاصة في تجمعات الخلايا في قاع الدورق. كان هذا التغيير المرئي هو العلامة الأولى على أن الخميرة قد استوعبت بنجاح الإنزيم البكتري وكانت تستخدمه لإنشاء الصبغة. وللتأكد مما يتم إنتاجه بالضبط، استخرج الباحثون الأصباغ من الخلايا وحللوها باستخدام أدوات متطورة. ووجدوا أن الخميرة كانت تنتج بالفعل كلاً من الإنديغو والإنديروبين. كان الإنديغو هو المنتج المهيمن، حيث ظهر بكميات أكبر بكثير، بينما كان الإنديروبين موجوداً بكميات أقل. أكد هذا أن المضيف من الخميرة يمكنه دعم الخطوات الكيميائية المعقدة المطلوبة لصنع كلا الجزيئين، وليس واحداً فقط.

مع عمل النظام الأساسي، اختبر الباحثون كيفية جعل العملية أكثر كفاءة عن طريق تغيير ظروف متنوعة. بدأوا بتعديل كمية الإندول المغذاة للخميرة. فعندما زادوا كمية الإندول من مستوى منخفض إلى 3 ميليمول لكل لتر، زادت كمية الصبغة الزرقاء المنتجة، لتصل إلى ذروة تقارب 20 مليجرام لكل لتر. ومع ذلك، عندما دفعوا التركيز إلى مستوى أعلى ليصل إلى 5 ميليمول لكل لتر، انخفض إنتاج كلا الصبغتين بشكل حاد. أشار هذا إلى أن الكثير من المادة الأولية كان في الواقع ضاراً بالخلايا أو يعيق عمل الإنزيم، وهي مشكلة شائعة في الأنظمة البيولوجية حيث يمكن للتركيزات العالية من مادة ما أن تسبب إجهاداً للكائن الحي.

بعد ذلك، نظروا في دور الميثانول، الذي يعمل كغذاء ومحفز لتشغيل جين الإنزيم في آن واحد. فقد اختبروا تركيزات تتراوح من 0.5% إلى 2.0%. ومن المثير للدهشة أن تغيير كمية الميثانول ضمن هذا النطاق لم يكن له تأثير كبير على كمية الصبغة المنتجة. وأشار هذا إلى أنه بمجرد إنتاج الإنزيم، لم تكن كمية الميثانول هي العامل الرئيسي الذي يحد من سرعة التفاعل. بدلاً من ذلك، من المرجح أن عوامل أخرى مثل توافر الأكسجين أو صحة الخلايا كانت أكثر أهمية. كما اختبر الباحثون المدة التي يجب أن تعمل فيها الخميرة؛ حيث أدت تمديد وقت الإنتاج من 24 ساعة إلى 72 ساعة إلى زيادة مستمرة في الصبغة، مع تسجيل أعلى الكميات عند علامة الثلاثة أيام. أظهر هذا أن الخميرة يمكن أن تظل نشطة ومنتجة لعدة أيام، محولة الإندول باستمرار إلى صبغة.

كان الأكسجين متغيراً حاسماً آخر. وجد الباحثون أنه إذا تُركت الدوارق ساكنة تماماً، دون أي هز، فلن يتم إنتاج أي صبغة على الإطلاق. وهذا منطقي لأن الإنزيم يحتاج إلى الأكسجين ليعمل. ومع ذلك، بمجرد هز الدوارق، فإن زيادة السرعة من وتيرة متوسطة إلى وتيرة أسرع لم تؤدِ إلى تعزيز المحصول بشكل كبير. اقترح هذا أن إمدادات الأكسجين في الدوارق الصغيرة المستخدمة كانت كافية بالفعل، وأن العائق يكمن في مكان آخر. كما جرب الفريق إضافة مواد كيميائية محددة لمعرفة ما إذا كان بإمكانها التأثير على التوازن بين الإنديغو الأزرق والإنديروبين الأحمر. أدت إضافة كمية صغيرة من الـ "L-cysteine"، وهو حمض أميني شائع، إلى تغيير نسبة الصبغتين، مما أدى إلى إزاحة الإنتاج قليلاً نحو المزيد من الإنديروبين. يشير هذا إلى أنه يمكن تعديل البيئة الكيميائية داخل الخلية لتفضيل أحد المنتجات على الآخر. في المقابل، أدت إضافة مادة خافضة للتوتر السطحي شائعة تسمى "Tween 80" بتركيزات عالية إلى إيقاف إنتاج الصبغة تماماً، ويرجح أن ذلك بسبب إتلاف أغشية الخلايا أو التداخل مع قدرة الإنزيم على العمل.

تخلص الدراسة إلى أن منصة الخميرة هذه تعد نقطة انطلاق قابلة للتطبيق لصنع هذه الأصباغ القيمة، لكنها ليست بعد عملية صناعية محسنة بالكامل. لقد أثبت الباحثون أن الخميرة يمكنها إنتاج كل من الإنديغو والإنديروبين، لكن الكميات حالياً أقل مما تم تحقيقه في الأنظمة البكتيرية المحسنة للغاية. يسلط العمل الضوء على أنه لتحسين الإنتاج، يجب أن تركز الجهود المستقبلية على تغذية الإندول بعناية لتجنب السمية، وإدارة إمدادات الأكسجين، وضبط الكيمياء الداخلية للخلة لتفضيل المنتج المطلوب. ومن خلال إثبات أن هذه الخميرة المحددة يمكنها استضافة هذا الإنزيم المحدد، تفتح الدراسة باباً جديداً لاستخدام الخلايا حقيقية النواة لتصنيع مواد كيميائية معقدة ذات قيمة مضافة بطريقة أكثر استدامة.