Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Eeuwenlang kwamen het diepblauw van denim en het levendige rood van bepaalde medicijnen van twee verschillende moleculen: indigo en indirubine. Indigo is de klassieke textielkleurstof die jeans zijn karakteristieke kleur geeft, terwijl zijn structurele neef, indirubine, een bioactieve verbinding is die wordt gevonden in traditionele kruidengeneeskunde en bekend staat om het beïnvloeden van hoe cellen groeien en communiceren. Lange tijd betekende de productie van deze stoffen dat men moest vertrouwen op chemische fabrieken die harde oplosmiddelen gebruiken en aanzienlijke hoeveelheden afval genereren. In de afgelopen jaren hebben wetenschappers zich tot de eigen machinerie van de natuur gekeerd — microben — om deze verbindingen schoner te maken. Door bacteriën en gisten te modificeren om als kleine chemische fabrieken te fungeren, kunnen onderzoekers hen voeden met eenvoudige startmaterialen en toekijken hoe ze die materialen transformeren in waardevolle pigmenten. De sleutel tot deze transformatie ligt vaak in een specifiek type enzym, een biologisch hulpmiddel dat zuurstof gebruikt om moleculen te modificeren, waardoor een kleurloos startblok wordt omgezet in een gekleurd product.

In een nieuwe studie onderzochten onderzoekers aan de Ajou Universiteit in Zuid-Korea of een specifiek type gist, bekend als Komagataella phaffii, getraind kon worden om deze taak uit te voeren. Hoewel bacteriën voor dit doel al eerder zijn gebruikt, biedt gist andere voordelen, zoals het vermogen om complexe eiwitvouwing aan te kunnen en te groeien tot zeer hoge dichtheden in industriële omgevingen. Het team richtte zich op een enzym genaamd MaFMO, dat afkomst even van een bacterie die in zwavelrijke omgevingen leeft. Dit enzym is een enkele, zelfstandige eenheid die een molecuul genaamd indol kan nemen en, met behulp van zuurstof en energie uit de cel, kan omzetten in de reactieve intermediairen die nodig zijn voor de vorming van indigo en indirubine. De onderzoekers wilden zien of ze dit bacteriële enzym succesvol in het genoom van de gist konden installeren en, zo ja, hoe verschillende omstandigheden zoals de hoeveelheid voedsel, de snelheid van het mengen en de toevoeging van bepaalde chemicaliën de uiteindelijke hoeveelheid blauw en rood pigment zouden beïnvloeden.

Het team begon door het gen voor het MaFMO-enzym in het DNA van de gist in te voegen, waardoor een stam werd gecreëerd die het enzym kan produceren wanneer deze wordt gevoed met methanol. Wanneer ze indol aan de cultuur toevoegden, was het resultaat onmiddellijk en zichtbaar. De gistcellen, die normaal gesproken een bleke crèmekleur hebben, veranderden in een duidelijk blauwe kleur, vooral in de klonten cellen onderin de kolf. Deze visuele verandering was het eerste teken dat de gist het bacteriële enzym succesvol had opgenomen en het gebruikte om pigment te creëren. Om precies te bevestigen wat er werd gemaakt, extraheerden de onderzoekers de pigmenten uit de cellen en analyseerden deze met geavanceerde instrumenten. Ze vonden dat de gist inderdaad zowel indigo als indirubine produceerde. Indigo was het dominante product en kwam in veel grotere hoeveelheden voor, terwijl indirubine in kleinere hoeveelheden aanwezig was. Dit bevestigde dat de gistgast de complexe chemische stappen kon ondersteunen die nodig zijn om beide moleculen te maken, en niet slechts één.

Met het basissysteem werkend, testten de onderzoekers hoe ze het proces efficiënter konden maken door verschillende omstandigheden te wijzigen. Ze begonnen met het aanpassen van de hoeveelheid toegevoegde indol aan de gist. Wanneer ze de hoeveelheid indol verhoogden van een laag niveau naar 3 millimol per liter, nam de hoeveelheid blauw pigment toe en bereikte een piek van bijna 20 milligram per liter. Echter, wanneer ze de concentratie verder verhoogden naar 5 millimol per liter, daalde de productie van beide pigmenten scherp. Dit suggereerde dat te veel van het startmateriaal eigenlijk schadelijk was voor de cellen of het werk van het enzym remde, een veelvoorkomend probleem in biologische systemen waarbij hoge concentraties van een stof de organisme stress bezorgen.

Vervolgens keken ze naar de rol van methanol, dat dient als zowel voedsel als de trigger om het enzymgen aan te zetten. Ze testten concentraties variërend van 0,5% tot 2,0%. Verrassend genoeg had het veranderen van de hoeveelheid methanol binnen dit bereik heel weinig effect op de hoeveelheid geproduceerd pigment. Dit gaf aan dat zodra het enzym werd geproduceerd, de hoeveelheid methanol niet de belangrijkste factor was die de snelheid van de reactie beperkte. In plaats daarvan waren andere factoren zoals de beschikbaarheid van zuurstof of de gezondheid van de cellen waarschijnlijk belangrijker. De onderzoekers testten ook hoe lang ze de gist moesten laten werken. Het verlengen van de productietijd van 24 uur naar 72 uur resulteerde in een gestage toename van het pigment, waarbij de hoogste hoeveelheden werden geregistreerd bij de drie-dagen markering. Dit toonde aan dat de gist meerdere dagen actief en productief kon blijven, waarbij het indol continu in pigment omzet.

Zuurstof was een andere cruciale variabele. De onderzoekers ontdekten dat als de kolven volledig stilstonden, zonder schudden, er helemaal geen pigment werd geproduceerd. Dit is logisch, omdat het enzym zuurstof nodig heeft om te functioneren. Echter, zodra de kolven werden geschud, leidde het verhogen van de snelheid van een matig tempo naar een sneller tempo niet tot een significante boost in de opbrengst. Dit suggereerde dat in de kleine kolven die werden gebruikt, de zuurstoftoevoer al voldoende was en dat de flessenhals elders lag. Het team experimenteerde ook met het toevoegen van specifieke chemicaliën om te zien of ze de balans tussen het blauwe indigo en het rode indirubine konden beïnvloeden. Het toevoegen van een kleine hoeveelheid L-cysteïne, een veelvoorkomend aminozuur, veranderde de verhouding van de twee pigmenten, waardoor de productie licht opschoof naar meer indirubine. Dit suggereert dat de chemische omgeving binnen de cel kan worden aangepast om één product boven het andere te bevoordelen. In tegenstelling hiertoe zorgde het toevoegen van een veelgebruikte surfactant genaamd Tween 80 bij hoge concentraties ervoor dat de pigmentproductie volledig stopte, waarschijnlijk omdat het de celmembranen beschadigde of de werking van het enzym verstoorde.

De studie concludeert dat dit gistplatform een levensvatbaar vertrekpunt is voor het maken van deze waardevolle pigmenten, maar dat het nog geen volledig geoptimaliseerd industrieel proces is. De onderzoekers hebben aangetoond dat de gist zowel indigo als indirubine kan produceren, maar de hoeveelheden zijn momenteel lager dan wat is bereikt in hoog geoptimaliseerde bacteriële systemen. Het werk benadrukt dat toekomstige inspanningen om de productie te verbeteren, zich moeten richten op het zorgvuldig voeden van de indol om toxiciteit te vermijden, het beheren van de zuurstoftoevoer en het fijn afstemmen van de interne chemie van de cel om een gewenst product te bevoordelen. Door te bewijzen dat deze specifieke gist dit specifieke enzym kan huisvesten, opent de studie een nieuwe deur voor het gebruik van eukaryote cellen om complexe, waardevolle chemicaliën op een duurzamere manier te produceren.