Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Durante siglos, el azul profundo del denim y el rojo vibrante de ciertos medicamentos han provenido de dos moléculas distintas: el índigo y la indirubina. El índigo es el tinte textil clásico que otorga a los jeans su color característico, mientras que su primo estructural, la indirubina, es un compuesto bioactivo que se encuentra en remedios herbales tradicionales, conocido por influir en cómo las células crecen y se comunican. Durante mucho tiempo, producir estas sustancias significaba depender de fábricas químicas que utilizan solventes agresivos y generan un desperdicio significativo. En años recientes, los científicos han recurrido a la propia maquinaria de la naturaleza —los microbios— para fabricar estos compuestos de manera más limpia. Al diseñar bacterias y levaduras para que actúen como diminutas fábricas químicas, los investigadores pueden alimentarlas con materiales de partida simples y observar cómo transforman esos materiales en pigmentos valiosos. La clave de esta transformación reside a menudo en un tipo específico de enzima, una herramienta biológica que utiliza oxígeno para modificar moléculas, convirtiendo un bloque de construcción incoloro en un producto coloreado.

En un nuevo estudio, investigadores de la Universidad de Ajou en Corea del Sur exploraron si un tipo específico de levadura, conocida como Komagataella phaffii, podría ser entrenada para realizar esta tarea. Aunque las bacterias se han utilizado para este propósito anteriormente, la levadura ofrece diferentes ventajas, como la capacidad de manejar el plegamiento de proteínas complejas y crecer a densidades muy altas en entornos industriales. El equipo se centró en una enzima llamada MaFMO, que proviene de una bacteria que vive en entornos ricos en azufre. Esta enzima es una unidad única y autónoma que puede tomar una molécula llamada indol y, utilizando oxígeno y energía de la célula, convertirla en los intermediarios reactivos necesarios para formar índigo e indirubina. Los investigadores querían ver si podían instalar con éxito esta enzima bacteriana en el genoma de la levadura y, de ser así, cómo diferentes condiciones como la cantidad de alimento, la velocidad de mezclado y la adición de ciertos productos químicos afectarían la cantidad final de pigmento azul y rojo producido.

El equipo comenzó insertando el gen para la enzima MaFMO en el ADN de la levadura, creando una cepa que pudiera producir la enzima al ser alimentada con metanol. Cuando añadieron indol al cultivo, el resultado fue inmediato y visible. Las células de la levadura, que normalmente eran de un color crema pálido, se volvieron de un azul distintivo, particularmente en los cúmulos de células en el fondo del matraz. Este cambio visual fue la primera señal de que la levadura había incorporado con éxito la enzima bacteriana y estaba utilizando su capacidad para crear pigmento. Para confirmar exactamente qué se estaba fabricando, los investigadores extrajeron los pigmentos de las células y los analizaron utilizando instrumentos sofisticados. Encontraron que la levadura estaba produciendo efectivamente tanto índigo como indirubina. El índigo era el producto dominante, apareciendo en cantidades mucho mayores, mientras que la indirubina estaba presente en cantidades menores. Esto confirmó que el huésped de la levadura podía soportar los complejos pasos químicos requeridos para fabricar ambas moléculas, no solo una.

Con el sistema básico funcionando, los investigadores probaron cómo hacer el proceso más eficiente cambiando diversas condiciones. Comenzaron ajustando la cantidad de indol suministrada a la levadura. Cuando aumentaron la cantidad de indol desde un nivel bajo hasta 3 milimoles por litro, la cantidad de pigmento azul producido aumentó, alcanzando un máximo de casi 20 miligramos por litro. Sin embargo, cuando elevaron la concentración a 5 milimoles por litro, la producción de ambos pigmentos cayó drásticamente. Esto sugirió que un exceso del material de partida era en realidad perjudicial para las células o inhibía el trabajo de la enzima, un problema común en sistemas biológicos donde las concentraciones altas de una sustancia pueden estresar al organismo.

A continuación, examinaron el papel del metanol, que sirve tanto de alimento como de activador para encender el gen de la enzima. Probaron concentraciones que iban desde el 0.5% hasta el 2.0%. Sorprendentemente, cambiar la cantidad de metanol dentro de este rango tuvo muy poco efecto en la cantidad de pigmento producido. Esto indicó que, una vez que la enzima se estaba produciendo, la cantidad de metanol no era el factor principal que limitaba la velocidad de la reacción. En cambio, otros factores como la disponibilidad de oxígeno o la salud de las células eran probablemente más importantes. Los investigadores también probaron cuánto tiempo debían trabajar la levadura. Extender el tiempo de producción de 24 a 72 horas resultó en un aumento constante del pigmento, registrándose las cantidades más altas a las tres jornadas. Esto demostró que la levadura podía permanecer activa y productiva durante varios días, convirtiendo continuamente el indol en pigmento.

El oxígeno era otra variable crítica. Los investigadores descubrieron que, si los matraces se dejaban completamente quietos, sin agitación, no se producía pigmento alguno. Esto tiene sentido porque la enzima necesita oxígeno para funcionar. Sin embargo, una vez que los matraces fueron agitados, aumentar la velocidad de un ritmo moderado a uno más rápido no aumentó significativamente el rendimiento. Esto sugirió que, en los pequeños matraces utilizados, el suministro de oxígeno ya era suficiente, y el cuello de botella residía en otra parte. El equipo también experimentó con la adición de productos químicos específicos para ver si podían influir en el equilibrio entre el índigo azul y la indirubina roja. Añadir una pequeña cantidad de L-cisteína, un aminoácido común, cambió la proporción de los dos pigmentos, desplazando la producción ligeramente hacia una mayor cantidad de indirubina. Esto sugiere que el entorno químico dentro de la célula puede ajustarse para favorecer un producto sobre el otro. En contraste, añadir un surfactante común llamado Tween 80 en concentraciones altas detuvo completamente la producción de pigmento, probablemente porque dañó las membranas celulares o interfirió con la capacidad de la enzima para trabajar.

El estudio concluye que esta plataforma de levadura es un punto de partida viable para fabricar estos pigmentos valiosos, pero aún no es un proceso industrial totalmente optimizado. Los investigadores demostraron que la levadura puede producir tanto índigo como indirubina, pero las cantidades son actualmente menores de lo que se ha logrado en sistemas bacterianos altamente optimizados. El trabajo destaca que, para mejorar la producción, los esfuerzos futuros deben centrarse en alimentar cuidadosamente el indol para evitar la toxicidad, gestionar el suministro de oxígeno y ajustar la química interna de la célula para favorecer el producto deseado. Al demostrar que esta levadura específica puede albergar esta enzima específica, el estudio abre una nueva puerta para el uso de células eucariotas en la fabricación de productos químicos complejos de valor añadido de una manera más sostenible.