Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

수 세기 동안 데님 특유의 짙은 푸른색과 특정 의약품의 선명한 붉은색은 인디고(indigo)와 인디루빈(indirubin)이라는 두 가지 서로 다른 분자에서 비롯되었습니다. 인디고는 청바지의 특징적인 색상을 부여하는 고전적인 섬유 염료인 반면, 그 구조적 형제인 인디루빈은 세포가 어떻게 성장하고 소통하는지에 영향을 미치는 것으로 알려진, 전통 약초 요법에서 발견되는 생리활성 화합물입니다. 오랫동안 이러한 물질들을 생산하기 위해서는 가혹한 용매를 사용하고 상당한 폐기물을 생성하는 화학 공장에 의존해야 했습니다. 최근 몇 년 사이, 과학자들은 이 화합물들을 더 깨끗하게 만들기 위해 자연의 자체 기계인 미생물로 눈을 돌렸습니다. 박테리아와 효모를 작은 화학 공장처럼 작동하도록 설계함으로써, 연구자들은 이들에게 단순한 시작 물질을 먹이고 그 물질들이 가치 있는 색소를 만드는 과정을 지켜볼 수 있습니다. 이 변환의 핵심은 종종 산소를 사용하여 분자를 수정하고, 무색의 시작 블록을 유색의 제품으로 바꾸는 생물학적 도구인 특정 유형의 효소에 달려 있습니다.

새로운 연구에서 대한민국 아주대학교의 연구진은 '코마가텔라 파피(Komagataella phaffii)'로 알려진 특정 유형의 효모가 이 과업을 수행할 수 있도록 훈련될 수 있는지 탐구했습니다. 박테리아가 이 목적으로 사용된 적이 있지만, 효모는 복잡한 단백질 접힘을 처리할 수 있는 능력이나 산업적 환경에서 매우 높은 밀도로 성장할 수 있는 능력과 같은 다른 장점들을 제공합니다. 연구팀은 황이 풍한 환경에서 서식하는 박테리아에서 유래한 MaFMO라는 효소에 집중했습니다. 이 효소는 단일한 독립 단위로서, 인돌(indole)이라는 분자를 가져와 세포의 에너지와 산소를 사용하여 인디고와 인디루빈을 형성하는 데 필요한 반응성 중간체로 전환할 수 있습니다. 연구진은 이 박테리아 효소를 효모 게놈에 성공적으로 설치할 수 있는지, 만약 그렇다면 음식의 양, 혼합 속도, 특정 화학 물질의 첨가와 같은 다양한 조건들이 최종적으로 생성되는 청색 및 적색 색소의 양에 어떻게 영향을 미치는지 알아보고자 했습니다.

연구팀은 먼저 효모의 DNA에 MaFMO 효소의 유전자를 삽입하여, 메탄올을 공급했을 때 효소를 생성할 수 있는 균주를 만들었습니다. 배양액에 인돌을 추가하자 결과는 즉각적이고 눈에 띄게 나타났습니다. 원래 연한 크림색이었던 효모 세포들은 특히 플라스크 바닥의 세포 덩어리 부분에서 뚜렷한 푸른색으로 변했습니다. 이 시각적 변화는 효모가 성공적으로 박테리아 효소를 받아들여 색소를 만드는 데 사용하고 있다는 첫 번째 신호였습니다. 정확히 무엇이 만들어지고 있는지 확인하기 위해 연구진은 세포에서 색소를 추출하여 정밀한 기기로 분석했습니다. 그들은 효모가 실제로 인디고와 인디루빈을 모두 생산하고 있음을 발견했습니다. 인디고가 지배적인 생성물로서 훨씬 더 많은 양으로 나타났으며, 인디루빈은 더 적은 양으로 존재했습니다. 이는 효모 숙주가 하나의 분자가 아닌 두 분자 모두을 만드는 데 필요한 복잡한 화학적 단계를 지원할 수 있음을 확인시켜 주었습니다.

기본적인 시스템이 작동하는 것을 확인한 후, 연구진은 다양한 조건을 변경하여 이 과정을 얼마나 더 효율적으로 만들 수 있는지 테스트했습니다. 그들은 먼저 효모에게 공급되는 인돌의 양을 조절하는 것으로 시작했습니다. 인돌의 양을 낮은 수준에서 리터당 3밀리몰까지 늘렸을 때, 생성된 청색 색소의 양은 증가하여 리터당 거의 20밀리그램의 정점에 도달했습니다. 그러나 농도를 리터당 5밀리몰로 더 높였을 때, 두 색소의 생산량은 급격히 떨어졌습니다. 이는 시작 물질이 너무 많으면 세포에 해롭거나 효소의 작용을 억제할 수 있음을 시사하며, 이는 높은 농도의 물질이 유기체에 스트레스를 줄 수 있는 생물학적 시스템에서 흔히 발생하는 문제입니다.

다음으로, 그들은 음식인 동시에 효소 유전자를 켜는 트리거 역할을 하는 메탄올의 역할을 살펴보았습니다. 그들은 0.5%에서 2.0% 사이의 농도를 테스트했습니다. 놀랍게도, 이 범위 내에서 메탄올의 양을 변화시키는 것은 색소 생성량에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 이는 일단 효소가 생성되고 나면, 메탄올의 양이 반응 속도를 제한하는 주요 요인이 아니라는 것을 나타냅니다. 대신, 산소의 가용성이나 세포의 건강 상태와 같은 다른 요인들이 아마도 더 중요할 것입니다. 연구진은 또한 효모가 얼마나 오랫동안 작업해야 하는지도 테스트했습니다. 생산 시간을 24시간에서 72시간으로 연장했을 때 색소량이 꾸준히 증가했으며, 3일째에 가장 많은 양이 기록되었습니다. 이는 효모가 며칠 동안 활발하게 활동하며 인돌을 색소로 지속적으로 전환할 수 있음을 보여주었습니다.

산소는 또 다른 결정적인 변수였습니다. 연구진은 플라스크를 흔들어주지 않고 완전히 가만히 두었을 경우, 색소가 전혀 생성되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이는 효소가 기능하기 위해 산소가 필요하기 때문에 타당한 결과입니다. 그러나 플라스크를 흔들어주기 시작했을 때, 흔드는 속도를 중간 속도에서 빠른 속도로 높여도 수율이 크게 증가하지는 않았습니다. 이는 사용된 작은 플라스크에서는 산소 공급이 이미 충분했음을 시사하며, 병목 현상은 다른 곳에 있었음을 의미합니다. 연구팀은 또한 특정 화학 물질을 첨가하여 청색 인디고와 적색 인디루빈 사이의 균형에 영향을 미칠 수 있는지 실험했습니다. 흔한 아미노산인 L-시스테인을 소량 첨가하면 두 색소의 비율이 변하여 인디루빈 쪽으로 약간 치우치는 결과를 보였습니다. 이는 세포 내부의 화학적 환경을 조정하여 한 제품을 다른 제품보다 선호하도록 만들 수 있음을 시사합니다. 반면, 흔한 계면활성제인 Tween 80을 고농도로 첨가하면 색소 생산이 완전히 중단되었는데, 이는 아마도 세포막을 손상시키거나 효소의 기능을 방해했기 때문일 것입니다.

이 연구는 이 효모 플랫폼이 이러한 가치 있는 색소를 만들기 위한 실행 가능한 출발점이지만, 아직 완전히 최적화된 산업 공정은 아니라고 결론짓습니다. 연구진은 효모가 인디고와 인디루빈을 모두 생산할 수 있음을 입증했지만, 현재의 양은 고도로 최적화된 박테리아 시스템에서 달성된 것보다 낮습니다. 이 연구는 생산성을 높이기 위해 향후 노력이 독성을 피하기 위한 세심한 인돌 공급, 산소 공급 관리, 그리고 원하는 제품을 선호하도록 세포의 내부 화학을 미세하게 조정하는 것에 집중되어야 함을 강조합니다. 이 특정 효모가 이 특정 효소를 수용할 수 있음을 증명함으로써, 본 연구는 진핵 세포를 사용하여 더 지속 가능한 방식으로 복잡하고 부가가치가 높은 화학 물질을 제조하는 새로운 문을 열었습니다.