Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Per secoli, il blu profondo del denim e il rosso vibrante di certi medicinali sono derivati da due molecole distinte: l'indaco e l'indirubina. L'indaco è il classico colorante tessile che conferisce ai jeans il loro colore caratteristico, mentre il suo cugino strutturale, l'indirubina, è un composto bioattivo presente nei rimedi erboristici tradizionali, noto per influenzare il modo in cui le cellule crescono e comunicano. Per molto tempo, la produzione di queste sostanze ha significato affidarsi a fabbriche chimiche che utilizzano solventi aggressivi e generano rifiuti significativi. Negli ultimi anni, gli scienziati si sono rivolti alla macchina stessa della natura — i microbi — per produrre questi composti in modo più pulito. Ingegnerizzando batteri e lieviti per agire come piccole fabbriche chimiche, i ricercatori possono nutrirli con semplici materiali di partenza e osservarli trasformare tali materiali in pigmenti preziosi. La chiave di questa trasformazione risiede spesso in un tipo specifico di enzima, uno strumento biologico che utilizza l'ossigeno per modificare le molecole, trasformando un blocco di partenza incolore in un prodotto colorato.

In uno studio recente, ricercatori dell'Università Ajou in Corea del Sud hanno esplorato se un tipo specifico di lievito, noto come Komagataella phaffii, potesse essere addestrato per svolgere questo compito. Sebbene i batteri siano stati usati in passato per questo scopo, il lievito offre vantaggi differenti, come la capacità di gestire il complesso ripiegamento delle proteine e di crescere fino a densità molto elevate in contesti industriali. Il team si è concentrato su un enzima chiamato MaFMO, che proviene da un batterio che vive in ambienti ricchi di zolfo. Questo enzima è un'unità singola e autonoma che può prendere una molecola chiamata indolo e, utilizzando l'ossigeno e l'energia della cellula, convertirla negli intermedi reattivi necessari per formare l'indaco e l'indirubina. I ricercatori volevano vedere se avessero successo nell'installare questo enzima batterico nel genoma del lievito e, in caso affermativo, come diverse condizioni come la quantità di cibo, la velocità di miscelazione e l'aggiunta di certe sostanze chimiche avrebbero influenzato la quantità finale di pigmento blu e rosso prodotta.

Il team ha iniziato inserendo il gene per l'enzima MaFMO nel DNA del lievito, creando un ceppo capace di produrre l'enzima quando alimentato con metanolo. Quando hanno aggiunto l'indolo alla coltura, il risultato è stato immediato e visibile. Le cellule di lievito, che normalmente sono di un colore crema pallido, sono diventate di un blu distinto, particolarmente nei grumi di cellule sul fondo del pallone. Questo cambiamento visivo è stata la prima segnalazione che il lievito aveva assunto con successo l'enzima batterico e lo stava usando per creare pigmento. Per confermare esattamente cosa fosse stato prodotto, i ricercatori hanno estratto i pigmenti dalle cellule e li hanno analizzati utilizzando strumenti sofisticati. Hanno scoperto che il lievito stava effettivamente producendo sia l'indaco che l'indirubina. L'indaco era il prodotto dominante, apparendo in quantità molto maggiori, mentre l'indirubina era presente in quantità minori. Ciò ha confermato che l'ospite di lievito poteva sostenere i complessi passaggi chimici necessari per produrre entrambe le molecole, non solo una.

Con il sistema di base funzionante, i ricercatori hanno poi testato come rendere il processo più efficiente cambiando varie condizioni. Hanno iniziato regolando la quantità di indolo somministrata al lievito. Quando hanno aumentato la quantità di indolo da un livello basso fino a 3 millimoli per litro, la quantità di pigmento blu prodotta è aumentata, raggiungendo un picco di quasi 20 milligrammi per litro. Tuttavia, quando hanno spinto la concentrazione più in alto, a 5 millimoli per litro, la produzione di entrambi i pigmenti è calata drasticamente. Ciò suggeriva che troppa materia prima fosse in realtà dannosa per le cellule o stesse inibendo il lavoro dell'enzima, un problema comune nei sistemi biologici in cui alte concentrazioni di una sostanza possono stressare l'organismo.

Successivamente, hanno esaminato il ruolo del metanolo, che funge sia da cibo che da stimolo per attivare il gene dell'enzima. Hanno testato concentrazioni che variavano dallo 0,5% al 2,0%. Sorprendentemente, cambiare la quantità di metanolo entro questo intervallo ha avuto pochissimo effetto sulla quantità di pigmento prodotta. Ciò ha indicato che, una volta che l'enzima veniva prodotto, la quantità di metanolo non era il fattore principale che limitava la velocità della reazione. Altri fattori, come la disponibilità di ossigeno o la salute delle cellule, erano probabilmente più importanti. I ricercatori hanno anche testato quanto tempo dovessero lasciare lavorare il lievito. Estendere il tempo di produzione da 24 a 72 ore ha portato a un aumento costante del pigmento, con le quantità massime registrate al terzo giorno. Ciò ha dimostrato che il lievito poteva rimanere attivo e produttivo per diversi giorni, convertendo continuamente l'indolo in pigmento.

L'ossigeno era un'altra variabile critica. I ricercatori hanno scoperto che se i palloni venivano lasciati completamente fermi, senza agitazione, non veniva prodotto alcun pigmento. Questo ha senso perché l'enzima ha bisogno di ossigeno per funzionare. Tuttavia, una volta che i palloni venivano agitati, aumentare la velocità da un ritmo moderato a uno più veloce non ha aumentato significativamente la resa. Ciò suggeriva che, nei piccoli palloni utilizzati, l'apporto di ossigeno era già sufficiente e il collo di bottiglia risiedeva altrove. Il team ha anche sperimentato l'aggiunta di sostanze chimiche specifiche per vedere se potevano influenzare l'equilibrio tra l'indaco blu e l'indirubina rossa. L'aggiunta di una piccola quantità di L-cisteina, un comune amminoacido, ha cambiato il rapporto tra i due pigmenti, spostando leggermente la produzione verso una maggiore quantità di indirubina. Ciò suggerisce che l'ambiente chimico all'interno della cellula può essere modificato per favorire un prodotto rispetto all'altro. Al contrario, l'aggiunta di un comune tensioattivo chiamato Tween 80 ad alte concentrazioni ha interrotto completamente la produzione di pigmento, probabilmente perché ha danneggiato le membrane cellulari o ha interferito con la capacità dell'enzima di operare.

Lo studio conclude che questa piattaforma di lievito è un punto di partenza valido per la produzione di questi pigmenti preziosi, ma non è ancora un processo industriale completamente ottimizzato. I ricercatori hanno dimostrato che il lievito può produrre sia l'indaco che l'indirubina, ma le quantità sono attualmente inferiori a quelle ottenute in sistemi batterici altamente ottimizzati. Il lavoro evidenzia che, per migliorare la produzione, gli sforzi futuri dovrebbero concentrarsi sulla somministrazione attenta dell'indolo per evitare la tossicità, sulla gestione dell'apporto di ossigeno e sull'affinamento della chimica interna della cellula per favorire il prodotto desiderato. Dimostrando che questo specifico lievito può ospitare questo specifico enzima, lo studio apre una nuova porta all'uso di cellule eucariotiche per fabbricare sostanze chimiche complesse e ad alto valore aggiunto in modo più sostenibile.