Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

几个世纪以来，丹宁的深蓝色和某些药物的鲜红色分别来自于两种不同的分子：靛蓝（indigo）和靛红（indirubin）。靛蓝是经典的纺织染料，赋予了牛仔裤其标志性的颜色；而其结构上的近亲——靛红，则是一种存在于传统草药疗法中的生物活性化合物，以影响细胞生长和通信而闻名。长期以来，生产这些物质意味着依赖使用剧毒溶剂并产生大量废弃物的化学工厂。近年来，科学家们转向利用自然界的自身机制——微生物——来更清洁地制造这些化合物。通过工程化改造细菌和酵母，使其成为微型化学工厂，研究人员可以喂食它们简单的起始原料，并观察它们如何将这些材料转化为有价值的颜料。这种转化的关键通常在于一种特定类型的酶，这是一种利用氧气来修饰分子的生物工具，能将无色的起始模块转化为有色的产物。

在一项新的研究中，韩国爱джу大学（Ajju University）的研究人员探索了是否可以训练一种被称为 Komagataella phaffii 的特定酵母来进行这项任务。虽然细菌此前已被用于此目的，但酵母提供了不同的优势，例如处理复杂蛋白质折叠的能力，以及在工业环境下生长到极高密度的能力。该团队专注于一种名为 MaFMO 的酶，这种酶来自一种生活在富含硫环境中的细菌。这种酶是一个单一且自给自足的单元，可以利用吲哚（indole）分子，结合氧气和细胞能量，将其转化为形成靛蓝和靛红所需的反应中间体。研究人员想要观察他们是否能成功地将这种细菌酶植入酵母基因组，以及如果可以，不同的条件（如食物量、搅拌速度和特定化学物质的添加）将如何影响最终产生的蓝色和红色颜料的数量。

团队首先通过将 MaFMO 酶的基因插入酵母的 DNA 中，创造出一种在喂食甲醇时能产生该酶的菌株。当他们向培养物中加入吲哚时，结果立竿见影且清晰可见。原本呈淡奶油色的酵母细胞变成了明显的蓝色，特别是在烧瓶底部的细胞团块中。这种视觉变化是第一个迹象，表明酵母已成功吸收了该细菌酶，并正在利用它来制造颜料。为了确切确认正在制造的是什么，研究人员从细胞中提取了颜料，并使用精密仪器进行了分析。他们发现酵母确实正在产生靛蓝和靛红。靛蓝是主要产物，产量明显更高，而靛红的含量较少。这证实了该酵母宿主能够支持制造这两种分子（而非仅仅一种）所需的复杂化学步骤。

在基本系统运作正常后，研究人员通过改变各种条件来测试如何提高效率。他们首先调整了喂给酵母的吲哚量。当他们将吲哚的浓度从低水平增加到每升 3 毫摩尔时，产生的蓝色颜料量随之增加，达到了每升近 20 毫克的峰值。然而，当他们将浓度推高到每升 5 毫摩尔时，两种颜料的产量都大幅下降。这表明过多的起始材料实际上对细胞有害，或者抑制了酶的工作，这是生物系统中常见的问题，即高浓度的物质会给生物体带来压力。

接下来，他们研究了作为食物和开启酶基因触发器的甲醇的作用。他们测试了从 0.5% 到 2.0% 不等的浓度。令人惊讶的是，改变甲醇的量在这一范围内对颜料产量几乎没有影响。这表明一旦酶被产生，甲醇的量并不是限制反应速度的主要因素。相反，其他因素如氧气的可用性或细胞的健康状况可能更为重要。研究人员还测试了应该让酵母工作多久。将生产时间从 24 小时延长到 72 小时，导致颜料量稳步增加，并在第三天记录到了最高产量。这表明酵母可以在数天内保持活跃和高效，不断地将吲哚转化为颜料。

氧气是另一个关键变量。研究人员发现，如果烧瓶完全静止、不进行摇晃，则不会产生任何颜料。这很好理解，因为该酶需要氧气才能发挥作用。然而，一旦开始摇晃烧瓶，将速度从中等速度增加到更快的速度，并没有显著提升产量。这表明在实验使用的这种小烧瓶中，氧气供应已经足够，瓶颈在于其他地方。团队还尝试添加特定的化学物质，以观察它们是否能影响蓝色靛蓝和红色靛红之间的平衡。添加少量的 L-半胱氨酸（一种常见的氨基酸）改变了两种颜料的比例，使生产略微向更多的靛红偏移。这表明细胞内部的化学环境可以通过微调来倾向于其中一种产物。相比之下，在高浓度下添加一种常见的表面活性剂 Tween 80 则完全停止了颜料的产生，这可能是因为它破坏了细胞膜或干扰了酶的工作能力。

研究结论认为，这种酵母平台是制造这些有价值颜料的一个可行起点，但它尚未成为一个完全优化的工业过程。研究人员证明了该酵母可以产生靛蓝和靛红，但目前的产量仍低于高度优化的细菌系统所能达到的水平。这项工作强调，为了提高产量，未来的努力应集中在通过精细控制吲哚的喂食以避免毒性、管理氧气供应，以及微调细胞内部化学环境以倾向于所需的产物。通过证明这种特定的酵母可以承载这种特定的酶，这项研究为使用真核细胞以更可持续的方式制造复杂的增值化学品打开了一扇新的大门。