Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Seit Jahrhunderten stammen das tiefe Blau von Denim und das leuchtende Rot bestimmter Medikamente von zwei unterschiedlichen Molekülen: Indigo und Indirubin. Indigo ist der klassische Textilfarbstoff, der Jeans ihre charakteristische Farbe verleiht, während sein struktureller Verwandter Indirubin eine bioaktive Verbindung ist, die in traditionellen pflanzlichen Heilmitteln vorkommt und dafür bekannt ist, das Zellwachstum und die Zellkommunikation zu beeinflussen. Lange Zeit bedeutete die Herstellung dieser Substanzen, sich auf chemische Fabriken verlassen zu müssen, die harte Lösungsmittel verwenden und erhebliche Mengen an Abfall erzeugen. In den letzten Jahren haben sich Wissenschaftler der eigenen Maschinerie der Natur zugewandt – Mikroben –, um diese Verbindungen sauberer herzustellen. Durch das gentechnische Design von Bakterien und Hefen, die als winzige chemische Fabriken fungieren, können Forscher sie mit einfachen Ausgangsmaterialien füttern und dabei zusehen, wie sie diese Materialien in wertvolle Pigmente verwandeln. Der Schlüssel zu dieser Transformation liegt oft in einer speziellen Art von Enzym, einem biologischen Werkzeug, das Sauerstoff verwendet, um Moleküle zu modifizieren und so einen farblosen Baustein in ein farbiges Produkt zu verwandeln.

In einer neuen Studie untersuchten Forscher der Ajou University in Südkorea, ob eine spezifische Art von Hefe, bekannt als Komagataella phaffii, trainiert werden könnte, um diese Aufgabe zu erfüllen. Während Bakterien bereits zuvor für diesen Zweck eingesetzt wurden, bietet Hefe andere Vorteile, wie etwa die Fähigkeit, komplexe Proteinfaltung zu bewältigen und in industriellen Umgebungen zu sehr hohen Dichten zu wachsen. Das Team konzentrierte sich auf ein Enzym namens MaFMO, das von einem Bakterium stammt, das in schwefelreichen Umgebungen lebt. Dieses Enzym ist eine einzelne, in sich geschlossene Einheit, die ein Molekül namens Indol aufnehmen und unter Verwendung von Sauerstoff und der Energie der Zelle in die reaktiven Zwischenprodukte umwandeln kann, die zur Bildung von Indigo und Indirubin benötigt werden. Die Forscher wollten sehen, ob es ihnen gelingen würde, dieses bakterielle Enzym erfolgreich in das Genom der Hefe einzusetzen, und falls ja, wie verschiedene Bedingungen wie die Menge der Nahrung, die Geschwindigkeit des Mischens und die Zugabe bestimmter Chemikalien die endgültige Menge des produzierten blauen und roten Pigments beeinflussen würden.

Das Team begann damit, das Gen für das MaFMO-Enzym in die DNA der Hefe einzufügen, wodurch einen Stamm erzeugte, der das Enzym produzieren konnte, wenn er mit Methanol gefütet wurde. Als sie Indol zur Kultur hinzufügten, war das Ergebnis unmittelbar und sichtbar. Die Hefezellen, die normalerweise eine blasscremefarbene Farbe hatten, färbten sich in ein deutliches Blau, insbesondere in den Zellklumpen am Boden des Kolbens. Diese visuelle Veränderung war das erste Anzeichen dafür, dass die Hefe das bakterielle Enzym erfolgreich aufgenommen hatte und es nutzte, um Pigment zu erzeugen. Um genau zu bestätigen, was hergestellt wurde, extrahierten die Forscher die Pigmente aus den Zellen und analysierten sie mit hochentwickelten Instrumenten. Sie fanden heraus, dass die Hefe tatsächlich sowohl Indigo als auch Indirubin produzierte. Indigo war das dominante Produkt und trat in wesentlich größeren Mengen auf, während Indirubin in kleineren Mengen vorhanden war. Dies bestätigte, dass der Hefewirt die komplexen chemischen Schritte unterstützen konnte, die zur Herstellung beider Moleküle erforderlich sind, und nicht nur eines.

Nachdem das Basissystem funktionierte, testeten die Forscher, wie man den Prozess effizienter gestalten könnte, indem man verschiedene Bedingungen änderte. Sie begannen damit, die Menge des zu den Hefen zu gebenden Indols anzupassen. Als sie die Menge des Indols von einem niedrigen Niveau auf 3 Millimol pro Liter erhöhten, stieg die Menge des produzierten blauen Pigments an und erreichte einen Spitzenwert von fast 20 Milligramm pro Liter. Als sie die Konzentration jedoch auf 5 Millimol pro Liter erhöhten, sank die Produktion beider Pigmente drastisch. Dies deutete darauf hin, dass zu viel des Ausgangsmaterials entweder schädlich für die Zellen war oder die Arbeit des Enzyms hemmte – ein häufiges Problem in biologischen Systemen, bei denen hohe Konzentrationen einer Substanz den Organismus stressen können.

Als Nächstes untersuchten sie die Rolle von Methanol, das sowohl als Nahrung als auch als Auslöser dient, um das Enzymgen zu aktivieren. Sie testeten Konzentrationen im Bereich von 0,5 % bis 2,0 %. Überraschenderweise hatte die Änderung der Methanolmenge innerhalb dieses Bereichs nur sehr wenig Einfluss darauf, wie viel Pigment produziert wurde. Dies deutete darauf hin, dass, sobald das Enzym produziert wurde, die Menge an Methanol nicht der entscheidende Faktor für die Geschwindigkeit der Reaktion war. Stattdessen waren andere Faktoren wie die Verfügbarkeit von Sauerstoff oder die Gesundheit der Zellen wahrscheinlich wichtiger. Die Forscher testeten auch, wie lange sie die Hefe arbeiten lassen sollten. Eine Verlängerung der Produktionszeit von 24 auf 72 Stunden führte zu einem stetigen Anstieg des Pigments, wobei die höchsten Mengen nach drei Tagen verzeichnet wurden. Dies zeigte, dass die Hefe über mehrere Tage hinweg aktiv und produktiv bleiben konnte und kontinuierlich das Indol in Pigment umwandelte.

Sauerstoff war eine weitere kritische Variable. Die Forscher fanden heraus, dass, wenn die Kolben völlig unbewegt blieben, also ohne Schütteln, überhaupt kein Pigment produziert wurde. Das ist logisch, da das Enzym Sauerstoff benötigt, um zu funktionieren. Sobald die Kolben jedoch geschüttelt wurden, führte eine Erhöhung der Geschwindigkeit von einem moderaten auf ein schnelleres Tempo nicht zu einer signifikanten Steigerung des Ertrags. Dies deutet darauf hin, dass die Sauerstoffversorgung in den verwendeten kleinen Kolben bereits ausreichend war und der Engpass an anderer Stelle lag. Das Team experimentierte auch mit der Zugabe spezifischer Chemikalien, um zu sehen, ob sie das Gleichgewicht zwischen dem blauen Indigo und dem roten Indirubin beeinflussen könnten. Die Zugabe einer geringen Menge L-Cystein, einer gängigen Aminosäure, veränderte das Verhältnis der beiden Pigmente und verschob die Produktion leicht in Richtung mehr Indirubin. Dies legt nahe, dass das chemische Milieu innerhalb der Zelle so angepasst werden kann, dass es ein Produkt gegenüber dem anderen bevorzugt. Im Gegensatz dazu stoppte die Zugabe eines gängigen Tensids namens Tween 80 in hohen Konzentrationen die Pigmentproduktion vollständig, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass es die Zellmembranen beschädigte oder die Fähigkeit des Enzyms zu arbeiten, störte.

Die Studie kommt zu dem Schluss, dass diese Hefeplattform ein praktikabler Ausgangspunkt für die Herstellung dieser wertvollen Pigmente ist, aber noch kein voll optimierter industrieller Prozess ist. Die Forscher zeigten, dass die Hefe sowohl Indigo als auch Indirubin produzieren kann, aber die Mengen liegen derzeit niedriger als das, was in hochoptimierten bakteriellen Systemen erreicht wurde. Die Arbeit unterstreicht, dass zukünftige Bemühungen zur Verbesserung der Produktion darauf abzielen sollten, das Füttern des Indols sorgfältig zu steuern, um Toxizität zu vermeiden, die Sauerstoffzufuhr zu managen und die interne Chemie der Zelle fein abzustimmen, um das gewünschte Produkt zu bevorzugen. Durch den Nachweis, dass diese spezifische Hefe dieses spezifische Enzym beherbergen kann, öffnet die Studie eine neue Tür für die Nutzung eukaryotischer Zellen, um komplexe, wertsteigernde Chemikalien auf eine nachhaltigere Weise herzustellen.