Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Durante séculos, o azul profundo do denim e o vermelho vibrante de certos medicamentos vieram de duas moléculas distintas: o índigo e a indirubina. O índigo é o corante têxtil clássico que confere aos jeans sua cor característica, enquanto seu primo estrutural, a indirubina, é um composto bioativo encontrado em remédios herbais tradicionais, conhecido por influenciar como as células crescem e se comunicam. Por muito tempo, produzir essas substâncias significou depender de fábricas químicas que utilizam solventes agressivos e geram resíduos significativos. Nos últimos anos, cientistas voltaram-se para a própria maquinaria da natureza — os micróbios — para produzir esses compostos de forma mais limpa. Ao projetar bactérias e leveduras para atuarem como minúsculas fábricas químicas, pesquisadores podem alimentá-las com materiais iniciais simples e observar a transformação desses materiais em pigmentos valiosos. A chave para essa transformação reside frequentemente em um tipo específico de enzima, uma ferramenta biológica que utiliza oxigênio para modificar moléculas, transformando um bloco inicial incolor em um produto colorido.

Em um novo estudo, pesquisadores da Universidade Ajou, na Coreia do Sul, exploraram se um tipo específico de levedura, conhecida como Komagataella phaffii, poderia ser treinada para realizar essa tarefa. Embora as bactérias tenham sido usadas para esse propósito anteriormente, a levedura oferece vantagens diferentes, como a capacidade de lidar com o dobramento de proteínas complexas e crescer em densidades muito altas em ambientes industriais. A equipe focou em uma enzima chamada MaFMO, que provém de uma bactéria que vive em ambientes ricos em enxofre. Esta enzima é uma unidade única e autossuficiente que pode pegar uma molécula chamada indol e, utilizando oxigênio e energia da célula, convertê-la nos intermediários reativos necessários para formar o índigo e a indirubina. Os pesquisadores queriam ver se conseguiriam instalar com sucesso essa enzima bacteriana no genoma da levedura e, se sim, como diferentes condições, como a quantidade de alimento, a velocidade de mistura e a adição de certos produtos químicos, afetariam a quantidade final de pigmento azul e vermelho produzidos.

A equipe começou inserindo o gene para a enzima MaFMO no DNA da levedura, criando uma linhagem capaz de produzir a enzima ao ser alimentada com metanol. Quando adicionaram indol à cultura, o resultado foi imediato e visível. As células de levedura, que eram normalmente de uma cor creme pálida, tornaram-se de um azul distinto, particularmente nos aglomerados de células no fundo do frasco. Essa mudança visual foi o primeiro sinal de que a levedura havia absorvido com sucesso a enzima bacteriana e estava usando-a para criar o pigmento. Para confirmar exatamente o que estava sendo produzido, os pesquisadores extraíram os pigmentos das células e os analisaram usando instrumentos sofisticados. Eles descobriram que a levedura estava, de fato, produzindo tanto o índido quanto a indirubina. O índigo era o produto dominante, aparecendo em quantidades muito maiores, enquanto a indirubina estava presente em quantidades menores. Isso confirmou que o hospedeiro de levedura podia suportar as etapas químicas complexas necessárias para fabricar ambas as moléculas, não apenas uma.

Com o sistema básico funcionando, os pesquisadores testaram como tornar o processo mais eficiente alterando várias condições. Começaram ajustando a quantidade de indol fornecida à levedura. Quando aumentaram a quantidade de indol de um nível baixo até 3 milimoles por litro, a quantidade de pigmento azul produzida aumentou, atingindo um pico de quase 20 miligramas por litro. No entanto, quando elevaram a concentração para 5 milimoles por litro, a produção de ambos os pigmentos caiu drasticamente. Isso sugeriu que o excesso do material inicial estava, na verdade, sendo prejudicial às células ou inibindo o trabalho da enzima, um problema comum em sistemas biológicos onde altas concentrações de uma substância podem estressar o organismo.

Em seguida, observaram o papel do metanol, que serve tanto como alimento quanto como o gatilho para ativar o gene da enzima. Eles testaram concentrações variando de 0,5% a 2,0%. Surpreendentemente, alterar a quantidade de metanol dentro dessa faixa teve muito pouco efeito na quantidade de pigmento produzida. Isso indicou que, uma vez que a enzima estava sendo produzida, a quantidade de metanol não era o fator principal que limitava a velocidade da reação. Em vez disso, outros fatores, como a disponibilidade de oxigênio ou a saúde das células, eram provavelmente mais importantes. Os pesquisadores também testaram por quanto tempo deveriam deixar a levedura trabalhar. Estender o tempo de produção de 24 para 72 horas resultou em um aumento constante no pigmento, com as quantidades mais altas registradas na marca de três dias. Isso mostrou que a levedura poderia permanecer ativa e produtiva por vários dias, convertendo continuamente o indol em pigmento.

O oxigênio foi outra variável crítica. Os pesquisadores descobriram que, se os frascos fossem deixados completamente parados, sem agitação, nenhum pigmento era produzido. Isso faz sentido porque a enzima precisa de oxigência para funcionar. No entanto, uma vez que os frascos foram agitados, aumentar a velocidade de um ritmo moderado para um mais rápido não impulsionou significativamente o rendimento. Isso sugeriu que, nos pequenos frascos utilizados, o suprimento de oxigênio já era suficiente, e o gargalo residia em outro lugar. A equipe também experimentou adicionar produtos químicos específicos para ver se poderiam influenciar o equilíbrio entre o índigo azul e a indirubina vermelha. Adicionar uma pequena quantidade de L-cisteína, um aminoácido comum, alterou a proporção dos dois pigmentos, deslocando a produção ligeiramente para mais indirubina. Isso sugere que o ambiente químico dentro da célula pode ser ajustado para favorecer um produto sobre o outro. Em contraste, adicionar um surfactante comum chamado Tween 80 em altas concentrações interrompeu completamente a produção de pigmento, provavelmente porque danificou as membranas celulares ou interferiu na capacidade da enzima de trabalhar.

O estudo conclui que esta plataforma de levedura é um ponto de partida viável para a fabricação desses pigmentos valiosos, mas ainda não é um processo industrial totalmente otimizado. Os pesquisadores demonstraram que a levedura pode produzir tanto o índigo quanto a indirubina, mas as quantidades são atualmente menores do que as alcançadas por sistemas bacterianos altamente otimizados. O trabalho destaca que, para melhorar a produção, os esforços futuros devem focar no fornecimento cuidadoso do indol para evitar toxicidade, no gerenciamento do suprimento de oxigênio e no ajuste fino da química interna da célula para favorecer o produto desejado. Ao provar que esta levedura específica pode hospedar esta enzima específica, o estudo abre uma nova porta para o uso de células eucarióticas para manufaturar produtos químicos complexos e de valor agregado de uma forma mais sustentável.