Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

何世紀もの間、デニムの深い青と特定の医薬品の鮮やかな赤は、インディゴとインジルービンという2つの異なる分子に由来してきました。インディゴは、ジーンズ特有の色を与える古典的な繊維染料です。一方、その構造上の親戚であるインジルービンは、伝統的な薬草療法に見られる生物活性化合物であり、細胞の成長や通信に影響を与えることが知られています。長い間、これらの物質を製造するには、激しい溶媒を使用し、多大な廃棄物を生成する化学工場に頼る必要がありました。近年、科学者たちは、よりクリーンにこれらの化合物を作るために、自然界自身の仕組みである微生物へと目を向けています。細菌や酵母を小さな化学工場として機能するように設計することで、研究者たちは単純な出発原料を彼らに与え、それらの原料を価値ある色素へと変化させる様子を見守ることができるのです。この変換の鍵となるのは、多くの場合、酸素を使用して分子を修飾し、無色の出発ブロックを有色の製品へと変える生物学的な道具である、特定のタイプの酵素です。

新しい研究において、韓国の亜州大学の研究チームは、コマガテラ・ファフィ（Komataella phaffii）として知られる特定の種類の酵母が、このタスクを実行するように訓練できるかどうかを調査しました。これまでこの目的には細菌が使用されてきましたが、酵母は、複雑なタンパク質の折り畳みを処理する能力や、工業的な環境で非常に高い密度まで増殖できる能力など、異なる利点を提供します。チームは、硫黄が豊富な環境に生息する細菌に由来する、MaFMOと呼ばれる酵素に焦点を当てました。この酵素は単一の自己完結したユニットであり、インドールと呼ばれる分子を取り込み、酸素と細胞のエネルギーを利用して、インディゴやインジルービンを形成するために必要な反応性中間体へと変換することができます。研究者たちは、この細菌由来の酵素を酵母のゲノムに正常に組み込むことができるか、そしてもしそうであれば、食物の量、混合の速度、特定の化学物質の添加といった異なる条件が、最終的な青と赤の色素の生成量にどのように影響するかを知りたいと考えました。

チームは、まずMaFMO酵素の遺伝子を酵母のDNAに挿入することから始め、メタノールを供給するとその酵素を生成する株を作り上げました。培養液にインドールを加えると、結果は即座に、かつ目に見える形で現れました。通常は淡いクリーム色の酵母細胞が、はっきりとした青色に変化し、特にフラスコ底部の細胞の塊が青くなりました。この視覚的な変化は、酵母が細菌由来の酵素を正常に取り込み、それを用いて色素を作成していることを示す最初の兆候でした。何が作られているのかを正確に確認するため、研究者たちは細胞から色素を抽出し、高度な機器を用いて分析しました。その結果、酵母は確かにインディゴとインジルービンを両方生産していることが分かりました。インディゴが主要な生成物であり、より大量に存在し、インジルービンはより少量存在していました。これにより、酵母のホストが、単一の分子だけでなく、両方の分子を作るために必要な複雑な化学ステップをサポートできることが確認されました。

基本的なシステムが機能することを確認した後、研究者たちは、様々な条件を変更することで、プロセスをより効率的にする方法をテストしました。まず、酵母に供給されるインドールの量を調整することから始めました。インドールの量を低いレベルから1リットルあたり3ミリモルまで増やしたところ、青い色素の生成量は増加し、1リットルあたり約20ミリグラムのピークに達しました。しかし、濃度を1リットルあたり5ミリモルまで押し上げると、両方の色素の生成量は急激に減少しました。このことは、出発原料が多すぎると細胞にとって有害であったり、酵素の働きを阻害したりすることを示唆しており、これは高濃度の物質が生物にストレスを与えるという、生物学的システムにおける一般的な問題です。

次に、彼らは、食物であると同時に酵素遺伝子をオンにするトリガーとしても機能するメタノールの役割を調べました。彼らは0.5%から2.0%の範囲の濃度をテストしました。驚いたことに、この範囲内でのメタノールの量の変化は、色素の生成量に対してほとんど影響を与えませんでした。これは、一度酵素が生成されると、メタノールの量が反応の速度を制限する主要な要因ではないことを示しています。代わりに、酸素の利用可能性や細胞の健康状態といった他の要因がより重要である可能性が高いと考えられます。また、研究者たちは、酵母をどのくらいの期間働かせるべきかもテストしました。生産時間を24時間から72時間に延長すると、色素は着実に増加し、3日目に最高量が記録されました。これは、酵母が数日間活動し続け、連続的にインドールを色素へと変換できることを示しています。

酸素もまた、極めて重要な変数でした。研究者たちは、フラスコを全く振らずに静止させた状態では、色素が全く生成されないことを見出しました。酵素が機能するために酸素を必要とするため、これは理にかなっています。しかし、フラスコを振った場合、回転速度を緩やかなペースから速いペースに上げても、収量は大幅には増えませんでした。これは、使用された小さなフラスコにおいては、酸素の供給はすでに十分であり、ボトルネックは他の場所にあったことを示唆しています。チームはまた、特定の化学物質を添加して、青いインディゴと赤いインジルービンのバランスに影響を与えられるかどうかを実験しました。一般的なアミノ酸であるL-システインを少量添加すると、2つの色素の比率が変化し、インジルービンの方へわずかにシフトしました。これは、細胞内の化学的環境を微調整することで、一方の生成物を他方よりも優先させることができることを示唆しています。対照的に、一般的な界面活性剤であるTween 80を高濃度で添加すると、色素の生成が完全に停止しました。これは、細胞膜を損傷したか、あるいは酵素の働きを妨げたためであると考えられます。

本研究は、この酵母プラットフォームがこれらの価値ある色素を作るための実行可能な出発点であるが、まだ完全に最適化された工業プロセスではないと結論付けています。研究者たちは、酵母がインディゴとインジルービンの両方を生産できることを実証しましたが、その量は現在、高度に最適化された細菌システムによって達成されているものよりも低くなっています。この研究は、生産を改善するためには、毒性を避けるための注意深いインドールの供給、酸素供給の管理、そして望ましい生成物を優先させるための細胞内の化学的環境の微調整に、今後の努力を集中させるべきであることを浮き彫りにしました。この特定の酵母がこの特定の酵素を宿すことができることを証明することで、本研究は、真核細胞を用いて、より持続可能な方法で複雑で付加価値の高い化学物質を製造するという、新たな扉を開いたのです。