Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1

Depuis des siècles, le bleu profond du denim et le rouge éclatant de certains médicaments proviennent de deux molécules distinctes : l'indigo et l'indirubine. L'indigo est le colorant textile classique qui donne aux jeans leur couleur caractéristique, tandis que son cousin structurel, l'indirubine, est un composé bioactif présent dans certains remèdes traditionnels à base de plantes, connu pour influencer la façon dont les cellules croissent et communiquent. Pendant longtemps, la production de ces substances impliquait de dépendre d'usines chimiques utilisant des solvants agressifs et générant des déchets importants. Ces dernières années, les scientifiques se sont tournés vers la propre machinerie de la nature — les microbes — pour produire ces composés de manière plus propre. En modifiant des bactéries et des levures pour qu'elles agissent comme de minuscules usines chimiques, les chercheurs peuvent les nourrir avec des matières premières simples et les regarder transformer ces matériaux en pigments précieux. La clé de cette transformation réside souvent dans un type spécifique d'enzyme, un outil biologique qui utilise l'oxygène pour modifier les molécules, transformant un bloc de départ incolore en un produit coloré.

Dans une nouvelle étude, des chercheurs de l'Université Ajou en Corée du Sud ont exploré si un type spécifique de levure, connue sous le nom de Komataella phaffii, pouvait être entraîné pour accomplir cette tâche. Bien que les bactéries aient été utilisées à cet effet auparavant, la levure offre des avantages différents, tels que la capacité de gérer le repliement complexe des protéines et de croître à des densités très élevées dans des contextes industriels. L'équipe s'est concentrée sur une enzyme appelée MaFMO, qui provient d'une bactérie vivant dans des environnements riches en soufre. Cette enzyme est une unité unique et autonome capable de prendre une molécule appelée indole et, en utilisant l'oxygène et l'énergie de la cellule, de la convertir en les intermédiaires réactifs nécessaires à la formation de l'indigo et de l'indirubine. Les chercheurs voulaient voir s'ils pouvaient installer avec succès cette enzyme bactérienne dans le génome de la levure et, si oui, comment différentes conditions comme la quantité de nourriture, la vitesse de mélange et l'ajout de certains produits chimiques affecteraient la quantité finale de pigment bleu et rouge produite.

L'équipe a commencé par insérer le gène de l'enzyme MaFMO dans l'ADN de la levure, créant ainsi une souche capable de produire l'enzyme lorsqu'elle est nourrie de méthanol. Lorsqu'ils ont ajouté de l'indole à la culture, le résultat fut immédiat et visible. Les cellules de levure, qui sont normalement d'une couleur crème pâle, sont devenues d'un bleu distinct, particulièrement dans les amas de cellules au fond du flacon. Ce changement visuel était le premier signe que la levure avait réussi à intégrer l'enzyme bactérienne et l'utilisait pour créer du pigment. Pour confirmer exactement ce qui était produit, les chercheurs ont extrait les pigments des cellules et les ont analysés à l'aide d'instruments sophistiqués. Ils ont découvert que la levure produisait effectivement de l'indigo et de l'indirubine. L'indigo était le produit dominant, apparaissant en quantités bien plus importantes, tandis que l'indirubine était présente en plus petites quantités. Cela a confirmé que l'hôte de levure pouvait supporter les étapes chimiques complexes requises pour fabriquer ces deux molécules, et non une seule.

Une fois le système de base opérationnel, les chercheurs ont ensuite testé comment rendre le processus plus efficace en modifiant diverses conditions. Ils ont commencé par ajuster la quantité d'indole fournie à la levure. Lorsqu'ils ont augmenté la quantité d'indole d'un niveau bas jusqu'à 3 millimoles par litre, la quantité de pigment bleu produite a augmenté, atteignant un pic de près de 20 milligrammes par litre. Cependant, lorsqu'ils ont poussé la concentration plus haut, à 5 millimoles par litre, la production des deux pigments a chuté brutalement. Cela suggérait qu'un excès de matière première était en fait nocif pour les cellules ou inhibait le travail de l'enzyme, un problème courant dans les systèmes biologiques où des concentrations élevées d'une substance peuvent stresser l'organisme.

Ensuite, ils ont examiné le rôle du méthanol, qui sert à la fois de nourriture et de déclencheur pour activer le gène de l'enzyme. Ils ont testé des concentrations allant de 0,5 % à 2,0 %. Étonnamment, changer la quantité de méthanol dans cette plage a eu très peu d'effet sur la quantité de pigment produite. Cela indiquait qu'une fois l'enzyme en production, la quantité de méthanol n'était pas le facteur principal limitant la vitesse de la réaction. Au lieu de cela, d'autres facteurs comme la disponibilité de l'oxygène ou la santé des cellules étaient probablement plus importants. Les chercheurs ont également testé combien de temps ils devaient laisser la levure travailler. Prolonger le temps de production de 24 heures à 72 heures a entraîné une augmentation constante du pigment, les quantités les plus élevées étant enregistrées à la marque des trois jours. Cela a montré que la levure pouvait rester active et productive pendant plusieurs jours, convertissant continuellement l'indole en pigment.

L'oxygène était une autre variable critique. Les chercheurs ont constaté que si les flacons restaient complètement immobiles, sans agitation, aucun pigment n'était produit. Cela est logique car l'enzyme a besoin d'oxygène pour fonctionner. Cependant, une fois les flacons agités, augmenter la vitesse d'un rythme modéré à un rythme plus rapide n'a pas augmenté de manière significative le rendement. Cela suggérait que dans les petits flacons utilisés, l'apport en oxygène était déjà suffisant, et que le goulot d'étranglement se situait ailleurs. L'équipe a également expérimenté l'ajout de produits chimiques spécifiques pour voir s'ils pouvaient influencer l'équilibre entre l'indigo bleu et l'indirubine rouge. L'ajout d'une petite quantité de L-cystéine, un acide aminé commun, a modifié le ratio des deux pigments, déplaçant légèrement la production vers plus d'indirubine. Cela suggère que l'environnement chimique à l'intérieur de la cellule peut être ajusté pour favoriser un produit plutôt qu'un autre. En revanche, l'ajout d'un tensioactif courant appelé Tween 80 à des concentrations élevées a complètement stoppé la production de pigment, probablement parce qu'il a endommagé les membranes cellulaires ou interféré avec la capacité de l'enzyme à fonctionner.

L'étude conclut que cette plateforme de levure est un point de départ viable pour fabriquer ces pigments précieux, mais qu'elle n'est pas encore un processus industriel pleinement optimisé. Les chercheurs ont démontré que la levure peut produire à la fois de l'indigo et de l'indirubine, mais que les quantités sont actuellement inférieures à ce qui a été atteint par des systèmes bactériens hautement optimisés. Le travail souligne que pour améliorer la production, les efforts futurs devraient se concentrer sur l'alimentation prudente en indole pour éviter la toxicité, la gestion de l'apport en oxygène et l'ajustement précis de la chimie interne de la cellule pour favoriser le produit souhaité. En prouvant que cette levure spécifique peut héberger cette enzyme spécifique, l'étude ouvre une nouvelle voie pour l'utilisation de cellules eucaryotes afin de fabriquer des produits chimiques complexes à valeur ajoutée de manière plus durable.