Biotransformation of indole to indigo and indirubin by engineered Komagataella phaffii expressing MaFMO from Methylophaga aminisulfidivorans SK1
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि मिथिलोट्रोफिक यीस्ट *Komagataella phaffii* को *Methylophaga aminisulfidivorans* SK1 से MaFMO नामक फ्लेविन-कंटेनिंग मोनोऑक्सीजिनेज व्यक्त करने के लिए इंजीनियर करना, इंडोल को इंडिगो और इंडिरूबिन में कुशल बायोट्रांसफॉर्मेशन करने में सक्षम बनाता है, जिसमें इष्टतम उपज 3 mM इंडोल सांद्रता और 72 घंटे की इंडक्शन अवधि पर प्राप्त की गई।
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सदियों से, डेनिम का गहरा नीला रंग और कुछ दवाओं का जीवंत लाल रंग दो अलग-अलग अणुओं से आता है: इंडिगो और इंडिरुबिन। इंडो (indigo) एक क्लासिक कपड़ा रंग है जो जींस को उनका विशिष्ट रंग देता है, जबकि इसका संरचनात्मक संबंधी, इंडिरुबिन (indirubin), एक बायोएक्टिव यौगिक है जो पारंपरिक हर्बल उपचारों में पाया जाता है, और कोशिकाओं के बढ़ने और संवाद करने के तरीके को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। लंबे समय तक, इन पदार्थों के उत्पादन का अर्थ रासायनिक कारखानों पर निर्भर रहना था जो कठोर सॉल्वैंट्स का उपयोग करते हैं और महत्वपूर्ण अपशिष्ट उत्पन्न करते हैं। हाल के वर्षों में, वैज्ञानिकों ने इन यौगिकों को अधिक स्वच्छ रूप से बनाने के लिए प्रकृति की अपनी मशीनरी—सूक्ष्मजीवों—की ओर रुख किया है। बैक्टीरिया और यीस्ट (yeast) को छोटे रासायनिक कारखानों के रूप में इंजीनियर करके, शोधकर्ता उन्हें सरल शुरुआती सामग्री खिला सकते हैं और उन सामग्रियों को मूल्यवान पिगमेंट में बदलते हुए देख सकते हैं। इस परिवर्तन की कुंजी अक्सर एक विशिष्ट प्रकार के एंजाइम में निहित होती है, जो एक जैविक उपकरण है जो अणुओं को संशोधित करने के लिए ऑक्सीजन का उपयोग करता है, जिससे एक रंगहीन शुरुआती ब्लॉक एक रंगीन उत्पाद में बदल जाता है।
एक नए अध्ययन में, दक्षिण कोरिया के अजू यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं ने यह पता लगाया कि क्या कोमागटेला फफी (Komagataella phaffii) नामक एक विशिष्ट प्रकार के यीस्ट को इस कार्य को करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है। हालांकि इस उद्देश्य के लिए पहले भी बैक्टीरिया का उपयोग किया जा चुका है, लेकिन यीस्ट विभिन्न लाभ प्रदान करता है, जैसे कि जटिल प्रोटीन फोल्डिंग को संभालने की क्षमता और औद्योगिक सेटिंग्स में बहुत उच्च घनत्व तक बढ़ने की क्षमता। टीम ने MaFMO नामक एक एंजाइम पर ध्यान केंद्रित किया, जो एक ऐसे बैक्टीरिया से आता है जो सल्फर-समृद्ध वातावरण में रहता है। यह एंजाइम एक एकल, आत्मनिर्भर इकाई है जो इंडोल (indole) नामक अणु को ले सकती है और, ऑक्सीजन और कोशिका की ऊर्जा का उपयोग करके, इसे इंडिगो और इंडिरुबिन बनाने के लिए आवश्यक प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती (intermediates) में बदल सकती है। शोधकर्ता यह देखना चाहते थे कि क्या वे इस बैक्टीरिया एंजाइम को सफलतापूर्वक यीस्ट के जीनोम में स्थापित कर सकते हैं और यदि हाँ, तो भोजन की मात्रा, मिश्रण की गति और कुछ रसायनों के जुड़ने जैसी विभिन्न स्थितियाँ नीले और लाल पिगमेंट के अंतिम उत्पादन को कैसे प्रभावित करती हैं।
टीम ने इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए जीन को यीस्ट के डीएनए में डाला, जिससे एक ऐसा स्ट्रेन तैयार हुआ जो मेथनॉल खिलाने पर एंजाइम का उत्पादन कर सकता था। जब उन्होंने कल्चर में इंडोल मिलाया, तो परिणाम तत्काल और दृश्यमान था। यीस्ट की कोशिकाएं, जो सामान्य रूप से हल्के क्रीम रंग की होती थीं, स्पष्ट रूप से नीली हो गईं, विशेष रूप से फ्लास्क के नीचे कोशिकाओं के गुच्छों में। यह दृश्य परिवर्तन पहला संकेत था कि यीस्ट ने सफलतापूर्वक उस बैक्टीरियल एंजाइम को ग्रहण कर लिया है और वह पिगमेंट बनाने के लिए उसका उपयोग कर रहा है। यह पुष्टि करने के लिए कि वास्तव में क्या बनाया जा रहा है, शोधकर्ताओं ने कोशिकाओं से पिगमेंट निकाला और परिष्कृत उपकरणों का उपयोग करके इसका विश्लेषण किया। उन्होंने पाया कि यीस्ट वास्तव में इंडिगो और इंडिरुबिन दोनों का उत्पादन कर रहा था। इंडिगो प्रमुख उत्पाद था, जो बहुत अधिक मात्रा में दिखाई दिया, जबकि इंडिरुबिन कम मात्रा में मौजूद था। इसने पुष्टि की कि यीस्ट होस्ट न केवल एक, बल्कि दोनों अणुओं को बनाने के लिए आवश्यक जटिल रासायनिक चरणों का समर्थन कर सकता है।
बुनियादी प्रणाली काम करने के साथ, शोधकर्ताओं ने विभिन्न स्थितियों को बदलकर इसे अधिक कुशल बनाने का परीक्षण किया। उन्होंने यीस्ट को दिए जाने वाले इंडोल की मात्रा को समायोजित करके शुरुआत की। जब उन्होंने इंडोल की मात्रा को निम्न स्तर से बढ़ाकर 3 मिलीमोल प्रति लीटर कर दिया, तो नीले पिगमेंट का उत्पादन बढ़ा, जो लगभग 20 मिलीग्राम प्रति लीटर के शिखर तक पहुँच गया। हालांकि, जब उन्होंने सांद्रता को बढ़ाकर 5 मिलीमोल प्रति लीटर कर दिया, तो दोनों पिगमेंट का उत्पादन तेजी से गिर गया। इससे पता चला कि बहुत अधिक शुरुआती सामग्री वास्तव में कोशिकाओं के लिए हानिकारक थी या एंजाइम के काम को बाधित कर रही थी, जो जैविक प्रणालियों में एक आम समस्या है जहाँ किसी पदार्थ की उच्च सांद्रता जीव को तनाव देती है।
इसके बाद, उन्होंने मेथनॉल की भूमिका को देखा, जो भोजन और एंजाइम जीन को चालू करने के ट्रिगर दोनों के रूप में कार्य करता है। उन्होंने 0.5% से 2.0% तक की सांद्रता का परीक्षण किया। आश्चर्यजनक रूप से, इस सीमा के भीतर मेथनॉल की मात्रा बदलने का पिगमेंट के उत्पादन पर बहुत कम प्रभाव पड़ा। इससे संकेत मिला कि एक बार जब एंजाइम का उत्पादन होने लगा, तो मेथनॉल की मात्रा प्रतिक्रिया की गति को सीमित करने वाला मुख्य कारक नहीं था। इसके बजाय, ऑक्सीजन की उपलब्धता या कोशिकाओं के स्वास्थ्य जैसे अन्य कारक अधिक महत्वपूर्ण थे। शोधकर्ताओं ने यह भी परीक्षण किया कि उन्हें यीस्ट को कितनी देर तक काम करने देना चाहिए। उत्पादन समय को 24 घंटे से बढ़ाकर 72 घंटे करने से पिगमेंट में निरंतर वृद्धि हुई, जिसमें उच्चतम मात्रा तीन दिन के निशान पर दर्ज की गई। इससे पता चला कि यीस्ट कई दिनों तक सक्रिय और उत्पादक रह सकता है, लगातार इंडोल को पिगमेंट में परिवर्तित कर सकता है।
ऑक्सीजन एक अन्य महत्वपूर्ण चर था। शोधकर्ताओं ने पाया कि यदि फ्लास्क को बिना हिलाए पूरी तरह से स्थिर छोड़ दिया जाता, तो कोई पिगमेंट नहीं बनता था। यह समझ में आता है क्योंकि एंजाइम को कार्य करने के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक बार जब फ्लास्क को हिलाया गया, तो गति को मध्यम से तेज करने से पैदावार में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई। इससे पता चला कि छोटे फ्लास्क में, ऑक्सीजन की आपूर्ति पहले से ही पर्याप्त थी, और बाधा कहीं और थी। टीम ने यह देखने के लिए विशिष्ट रसायनों को जोड़कर प्रयोग भी किया कि क्या वे नीले इंडिगो और लाल इंडिरुबिन के बीच के संतुलन को प्रभावित कर सकते हैं। एल-सिस्टीन (L-cysteine), जो एक सामान्य अमीनो एसिड है, की थोड़ी मात्रा जोड़ने से दोनों पिगमेंट का अनुपात बदल गया, जिससे उत्पादन थोड़ा अधिक इंडिरुबिन की ओर झुक गया। यह सुझाव देता है कि कोशिका के भीतर रासायनिक वातावरण को एक उत्पाद के पक्ष में दूसरे के ऊपर झुकाया जा सकता है। इसके विपरीत, ट्विन 80 (Tween 80) नामक एक सामान्य सर्फेक्टेंट को उच्च सांद्रता में मिलाने से पिगमेंट उत्पादन पूरी तरह से रुक गया, संभवतः इसलिए क्योंकि इसने कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुँचाया या एंजाइम की कार्य करने की क्षमता में हस्तक्षेप किया।
अध्ययन यह निष्कर्ष निकालता है कि यह यीस्ट प्लेटफॉर्म इन मूल्यवान पिगमेंट को बनाने के लिए एक व्यवहार्य शुरुआती बिंदु है, लेकिन यह अभी तक एक पूरी तरह से अनुकूलित औद्योगिक प्रक्रिया नहीं है। शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया कि यीस्ट इंडिगो और इंडिरुबिन दोनों का उत्पादन कर सकता है, लेकिन वर्तमान में इनकी मात्रा अत्यधिक अनुकूलित बैक्टीरिया प्रणालियों द्वारा प्राप्त मात्रा से कम है। यह कार्य इस बात पर प्रकाश डालता है कि सुधार के लिए, भविष्य के प्रयासों को विषाक्तता से बचने के लिए इंडोल को सावधानीपूर्वक खिलाने, ऑक्सीजन की आपूर्ति का प्रबंधन करने और वांछित उत्पाद के पक्ष में कोशिका के आंतरिक रसायन विज्ञान को सूक्ष्म रूप से ट्यून करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। यह सिद्ध करके कि यह विशिष्ट यीस्ट इस विशिष्ट एंजाइम को होस्ट कर सकता है, यह अध्ययन अधिक टिकाऊ तरीके से जटिल, मूल्य-वर्धित रसायनों के निर्माण के लिए यूकेरियोटिक कोशिकाओं का उपयोग करने हेतु एक नया द्वार खोलता है।
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