Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि यद्यपि CRISPR/Cas12a एक एकल प्रमोटर से कई gRNAs को संसाधित कर सकता है, लेकिन युग्मित गाइड-प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के माध्यम से लक्षित जीनोमिक लोकी को हटाने में इसकी दक्षता स्तनधारी कोशिकाओं में संवेदनशील नकारात्मक चयन परख (negative selection assays) का समर्थन करने के लिए बहुत कम है।
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मानव जीनोम का अधिकांश हिस्सा प्रोटीन बनाने के ब्लूप्रिंट के रूप में नहीं है, जो हमारे शरीर के निर्माण खंड हैं। इसके बजाय, हमारे डीएनए का एक बड़ा हिस्सा गैर-कोडिंग (noncoding) अनुक्रमों से बना है जो स्विच, डिमर और निर्देश पुस्तिकाओं की तरह काम करते हैं, जो जीन को बताते हैं कि कब चालू या बंद होना है। वैज्ञानिक लंबे समय से संदेह करते रहे हैं कि ये छिपे हुए क्षेत्र कई बीमारियों और लक्षणों को समझने की कुंजी रखते हैं, फिर भी इनका अध्ययन करना कठिन है। जीन को संपादित करने के लिए मानक उपकरण, जिसे CRISPR कहा जाता है, डीएनए में एक एकल कट लगाने का काम करता है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर एक छोटी, अव्यवस्थित त्रुटि होती है जो जीन के कार्य को तोड़ देती है। हालांकि यह प्रोटीन-कोडिंग जीन को बंद करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन यह गैर-कोडिंग क्षेत्रों के लिए अक्सर बहुत ही मोटा औजार साबित होता है, जहाँ लक्ष्य डीएनए के एक विशिष्ट खंड को पूरी तरह से हटा देना होता है ताकि देखा जा सके कि उसके हटने पर क्या होता है। इन क्षेत्रों को वास्तव में समझने के लिए, शोधकर्ताओं को एक ऐसे तरीके की आवश्यकता है जिससे वे जीनोम के एक सटीक टुकड़े को काट सकें और कोशिका की प्रतिक्रिया देख सकें, एक ऐसी प्रक्रिया जिसमें एक साथ दो कट लगाने और उम्मीद करने की आवश्यकता होती है कि कोशिका उनके बीच के हिस्से को हटा देगी।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने यह परीक्षण करने के लिए हाथ आजमाया कि क्या CRISPR प्रणाली का एक विशिष्ट संस्करण, जिसे Cas12a कहा जाता है, इस नाजुक डबल-कट ऑपरेशन को बड़े पैमाने पर प्रयोगों में उपयोग करने के लिए पर्याप्त कुशलता से कर सकता है। अधिक सामान्य CRISPR टूल के विपरीत, Cas12a में एक एकल शुरुआती बिंदु से निर्देशों की एक लंबी श्रृंखला को कई अलग-अलग कटिंग गाइड्स में संसाधित करने की अनूठी क्षमता है। इस विशेषता ने सुझाव दिया कि यह एक हाई-थ्रूपुट स्क्रीन के लिए एकदम सही उम्मीदवार हो सकता है, जहाँ हजारों अलग-अलग डीएनए खंडों का एक साथ परीक्षण किया जाता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि कौन से खंड कोशिका के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। शोधकर्ताओं ने आनुवंशिक निर्देशों की एक विशाल लाइब्रेरी डिजाइन की जिसका उद्देश्य आवश्यक जीन (जिनके बिना कोशिका जीवित नहीं रह सकती) और गैर-आवश्यक जीन (जिनके बिना कोशिका जीवित रह सकती है) दोनों में डीएनए के विशिष्ट खंडों के ठीक पहले और ठीक बाद के क्षेत्रों को लक्षित करना था। योजना सरल थी: यदि प्रणाली काम करती है, तो Cas12a एंजाइम दो कट लगाएगा, कोशिका उस खंड को हटा देगी, और वे कोशिकाएं जो इन निर्देशों को ले जाती हैं, मर जाएंगी यदि वह खंड महत्वपूर्ण था।
टीम ने इन निर्देशों को लाखों मानव त्वचा कैंसर कोशिकाओं में पेश किया और तीन सप्ताह तक जनसंख्या में होने वाले बदलावों को देखा। उन्हें उम्मीद थी कि यदि प्रणाली सफलतापूर्वक आवश्यक खंडों को हटा देती है, तो उन विशिष्ट निर्देशों को ले जाने वाली कोशिकाएं जनसंख्या से गायब हो जाएंगी, ठीक वैसे ही जैसे वे तब होती हैं जब किसी जीन को सीधे तौर पर तोड़ा जाता है। हालांकि, परिणाम उनकी उम्मीदों से बहुत दूर थे। जबकि नियंत्रण (controls) पूरी तरह से काम कर रहे थे—जिन कोशिकाओं में आवश्यक जीन को सीधे तोड़ने के निर्देश थे वे अपेक्षित रूप से मर गईं—दो कट के बीच के खंडों को हटाने के निर्देशों वाली कोशिकाओं की संख्या में लगभग कोई बदलाव नहीं देखा गया। डीएनए खंड शायद ही कभी हटाए जा रहे थे। शोधकर्ताओं ने डेटा का विश्लेषण किया ताकि वे देख सकें कि क्या वे कोई ऐसा पैटर्न ढूंढ सकते हैं जो इस प्रणाली को बेहतर बना सके। उन्होंने निर्देशों के विशिष्ट अनुक्रमों, दो कट्स के बीच की दूरी, कट्स की दिशा, और यहाँ तक कि पास के डीएनए की रासायनिक संरचना को भी देखा। इनमें से किसी भी कारक ने कोई सार्थक अंतर नहीं दिखाया। डबल-कट विधि की दक्षता इतनी कम रही कि यह रैंडम चांस (random chance) से अलग नहीं थी, जो यह पहचानने के लिए स्पष्ट संकेत देने में विफल रही कि कौन से डीएनए खंड महत्वपूर्ण हैं।
इस अध्ययन ने एक अन्य शोध समूह द्वारा उपयोग किए गए एक समान दृष्टिकोण के साथ भी तुलना की, जिसने समान लक्ष्य प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग CRISPR एंजाइमों को मिलाया था। उस अधिक जटिल सेटअप के साथ भी, डीएनए खंडों को हटाने की सफलता दर इतनी कम थी कि वह बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी नहीं थी। लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि हालांकि Cas12a प्रणाली एकल कट लगाने के लिए शक्तिशाली है, लेकिन इसमें वर्तमान में लक्षित लोकी (loci) को निकालने के लिए आवश्यक विश्वसनीयता नहीं है जिससे वैज्ञानिक एक साथ हजारों आनुवंशिक क्षेत्रों की स्क्रीनिंग कर सकें। यह विफलता संभवतः इस तथ्य से उत्पन्न होती है कि एक खंड को हटाने के लिए आवश्यक दो कट हर कोशिका में बिल्कुल एक ही समय पर नहीं होते हैं, या कोशिका के रिपेयर मैकेनिज्म हमेशा बीच के हिस्से को हटाने के लिए सिरों को जोड़ने में सक्षम नहीं होते हैं। जब तक टूल्स में सुधार करके इन एक साथ कटों को अधिक निरंतरता से लगाना संभव नहीं होता, तब तक खंडों को हटाने की यह विशिष्ट विधि उस व्यापक, व्यवस्थित अन्वेषण के लिए अनुपयुक्त बनी रहेगी जिसकी वैज्ञानिकों ने कल्पना की थी।
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