Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
본 연구는 CRISPR/Cas12a가 단일 프로모터로부터 다수의 gRNA를 가공할 수 있음에도 불구하고, 쌍을 이룬 가이드에 의해 유도된 이중 가닥 절단(double-strand breaks)을 통해 표적 유전체 부위를 절제하는 효율이 포유류 세포에서의 민감한 음성 선택 분석을 지원하기에는 너무 낮다는 것을 입증한다.
원본 논문은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스로 제공됩니다. 이것은 동료 심사를 거치지 않은 프리프린트의 AI 생성 설명입니다. 의학적 조언이 아닙니다. 이 내용을 바탕으로 건강 관련 결정을 내리지 마세요. 전체 면책 조항 읽기
인간 게놈의 대부분은 우리 몸의 구성 성분인 단백질을 만드는 설계도가 아닙니다. 대신, 우리 DNA의 대다수는 유전자가 언제 켜지고 꺼질지를 알려주는 스위치, 조광기(dimmer), 그리고 설명서와 같은 역할을 하는 비부호화 서열로 구성되어 있습니다. 과학자들은 오랫동안 이 숨겨진 영역들이 많은 질병과 형질을 이해하는 열쇠를 쥐고 있다고 의심해 왔지만, 이를 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 유전자를 편집하는 표준 도구로 알려진 CRISPR는 DNA에 단 한 번의 절단을 가하는데, 이는 보통 유전자의 기능을 망가뜨리는 작고 지저지고 불완전한 오류를 발생시킵니다. 이는 단백질을 코딩하는 유전자를 끄는 데는 탁월하지만, 특정 DNA 구간을 완전히 제거하여 그것이 사라졌을 때 어떤 일이 일어나는지 확인하는 것이 목적인 비부호화 영역에는 너무 투박한 도구인 경우가 많습니다. 이러한 영역을 진정으로 이해하기 위해, 연구자들은 게놈의 정밀한 조각을 잘라내고 세포가 어떻게 반응하는지 관찰할 수 있는 방법이 필요하며, 이 과정은 한 번에 두 번의 절단을 가하고 그 사이의 조각이 삭제되기를 기대하는 과정을 필요로 합니다.
한 연구팀은 Cas12a라고 불리는 특정 버전의 CRISPR 시스템이 대규모 실험에 사용될 수 있을 만큼 효율적으로 이 섬세한 이중 절단 작업을 수행할 수 있는지 테스트하기 위해 연구를 시작했습니다. 더 흔한 CRISPR 도구와 달리, Cas12a는 단일 시작점에서 긴 명령 문자열을 여러 개의 별도 절단 가이드로 처리할 수 있는 독특한 능력을 갖추고 있습니다. 이 특징은 세포의 생존에 필수적인 요소가 무엇인지 찾기 위해 수천 개의 서로 다른 DNA 구간을 동시에 테스트하는 고처리량 스크리닝(high-throughput screen)에 완벽한 후보가 될 수 있음을 시사했습니다. 연구진은 세포가 생존할 수 없는 필수 유전자와 세포가 생존할 수 있는 비필수 유전자 모두에서 특정 DNA 구간의 바로 앞과 뒤 영역을 표적으로 하는 방대한 유전적 명령 라이브러리를 설계했습니다. 계획은 간단했습니다. 만약 이 시스템이 작동한다면, Cas12a 효소가 두 번의 절단을 가할 것이고, 세포는 그 사이의 구간을 삭제할 것이며, 이 명령을 가진 세포들은 만약 그 구간이 필수적이라면 죽게 될 것이라는 점이었습니다.
연구팀은 이 명령들을 수백만 개의 인간 피부암 세포에 도입하고 3주 동안 인구 집단이 어떻게 변화하는지 관찰했습니다. 그들은 만약 시스템이 필수적인 구간을 성공적으로 제거한다면, 유전자를 직접적으로 망가뜨릴 때와 마찬가지로 해당 명령을 가진 세포들이 집단에서 사라질 것이라고 예상했습니다. 그러나 결과는 그들이 희망했던 것과는 거리가 멀었습니다. 대조군, 즉 필수 유전자를 직접적으로 망가뜨리라는 명령을 가진 세포들은 예상대로 죽었지만, 두 번의 절단 사이에 구간을 제거하라는 명령을 가진 세포들은 수치상 거의 아무런 변화를 보이지 않았습니다. DNA 구간은 거의 제거되지 않았습니다. 연구진은 시스템을 더 잘 작동하게 만들 수 있는 패턴을 찾을 수 있는지 확인하기 위해 데이터를 분석했습니다. 그들은 명령의 특정 서열, 절단 사이의 거리, 절단의 방향, 심지어 주변 DNA의 화학적 조성까지 살펴보았습니다. 이러한 요소 중 그 어떤 것도 의미 있는 차이를 만들어내지 못했습니다. 이중 절단 방식의 효율성은 너무 낮아 무작위 확률과 구별할 수 없는 수준이었으며, 어떤 DNA 구간이 중요한지를 식별하는 데 필요한 명확한 신호를 만들어내는 데 실패했습니다.
또한 이 연구는 동일한 목표를 달로 하기 위해 두 가지 서로 다른 CRISPR 효소를 결합한 다른 연구 그룹의 유사한 접근 방식과 결과를 비교했습니다. 더 복잡한 설정임에도 불구하고, DNA 구간을 제거하는 성공률은 대규모 스크리닝에 사용하기에는 너무 낮았습니다. 저자들은 Cas12a 시스템이 단일 절단을 만드는 데는 강력하지만, 과학자들이 한 번에 수천 개의 유전 영역을 스크리닝할 수 있게 하는 방식으로 표적 로커스(loci)를 절제하는 데 필요한 신뢰성을 현재로서는 갖추고 있지 않다고 결론지었습니다. 이러한 실패는 아마도 구간을 제거하는 데 필요한 두 번의 절단이 모든 세포에서 정확히 동시에 일어나지 않거나, 세포의 복구 기제가 항상 중간 조각을 삭제하는 방식으로 끝을 연결하지 않기 때문일 것입니다. 도구가 이러한 동시 절단을 더 일관되게 수행할 수 있도록 개선되기 전까지, 이 특정 방식의 DNA 구간 제거법은 과학자들이 구상했던 비부호화 게놈에 대한 광범위하고 체계적인 탐사에는 부적합한 상태로 남아 있습니다.
연구 분야의 논문에 파묻히고 계신가요?
연구 키워드에 맞는 최신 논문의 일일 다이제스트를 받아보세요 — 기술 요약 포함, 당신의 언어로.