Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Este estudo demonstra que, embora o CRISPR/Cas12a possa processar múltiplos gRNAs a partir de um único promotor, sua eficiência em excisar loci genômicos alvo via quebras de fita dupla induzidas por guias pareados é baixa demais para suportar ensaios de seleção negativa sensíveis em células de mamíferos.
Artigo original sob licença CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Esta é uma explicação gerada por IA de um preprint que não foi revisado por pares. Não é aconselhamento médico. Não tome decisões de saúde com base neste conteúdo. Ler aviso legal completo
A maior parte do genoma humano não é um projeto para a fabricação de proteínas, os blocos de construção de nossos corpos. Em vez disso, a vasta maioria do nosso DNA consiste em sequências não codificantes que atuam mais como interruptores, dimmers e manuais de instrução, dizendo aos genes quando ligar ou desligar. Cientistas há muito suspeitam que essas regiões ocultas detêm as chaves para compreender muitas doenças e características, mas estudá-las é difícil. A ferramenta padrão para editar genes, conhecida como CRISPR, funciona fazendo um único corte no DNA, o que geralmente resulta em um erro pequeno e desordenado que quebra a função de um gene. Embora isso seja excelente para desligar um gene codificador de proteína, é frequentemente um instrumento bruto demais para regiões não codificantes, onde o objetivo é remover um segmento específico de DNA inteiramente para ver o que acontece quando ele é removido. Para compreender verdadeiramente essas regiões, os pesquisadores precisam de uma maneira de recortar um pedaço preciso do genoma e observar como a célula reage, um processo que requer fazer dois cortes ao mesmo tempo e esperar que a célula delete a peça entre eles.
Uma equipe de pesquisadores partiu para testar se uma versão específica do sistema CRISPR, chamada Cas12a, poderia realizar essa operação delicada de corte duplo com eficiência suficiente para ser usada em experimentos de larga escala. Diferente da ferramenta CRISPR mais comum, a Cas12a possui a habilidade única de processar uma longa sequência de instruções em muitos guias de corte separados a partir de um único ponto de partida. Essa característica sugeriu que ela poderia ser a candidata perfeita para uma triagem de alto rendimento, onde milhares de diferentes segmentos de DNA são testados simultaneamente para encontrar quais são essenciais para a sobrevivência de uma célula. Os pesquisadores desenharam uma biblioteca massiva de instruções genéticas destinadas a visar as regiões logo antes e logo depois de seções específicas de DNA tanto em genes essenciais, dos quais as células não podem viver sem, quanto em genes não essenciais, dos quais as células podem sobreviver sem. O plano era simples: se o sistema funcionasse, a enzima Cas12a faria dois cortes, a célula deletaria o segmento entre eles e as células carregando essas instruções morreriam se esse segmento fosse vital.
A equipe introduziu essas instruções em milhões de células de câncer de pele humano e observou como a população mudava ao longo de três semanas. Eles esperavam que, se o sistema removesse com sucesso os segmentos essenciais, as células carregando essas instruções específicas desapareceriam da população, tal como ocorre quando um gene é diretamente quebrado. No entanto, os resultados ficaram longe do que esperavam. Embora os controles tenham funcionado perfeitamente — células com instruções para quebrar diretamente genes essenciais morreram como esperado — as células com instruções para remover os segmentos entre dois cortes mostraram quase nenhuma mudança em seus números. Os segmentos de DNA raramente estavam sendo removidos. Os pesquisadores analisaram os dados para ver se poderiam encontrar um padrão que fizesse o sistema funcionar melhor. Eles examinaram as sequências específicas das instruções, a distância entre os dois cortes, a direção para a qual os cortes apontavam e até mesmo a composição química do DNA próximo. Nenhum desses fatores fez uma diferença significativa. A eficiência do método de corte duplo permaneceu tão baixa que era indistinguível do acaso, falhando em produzir o sinal claro necessário para identificar quais segmentos de DNA eram críticos.
O estudo também comparou seus resultados com uma abordagem semelhante usada por outro grupo de pesquisa que combinou duas enzimas CRISPR diferentes para alcançar o mesmo objetivo. Mesmo com essa configuração mais complexa, a taxa de sucesso para a remoção de segmentos de DNA foi baixa demais para ser útil em triagens de larga escala. Os autores concluíram que, embora o sistema Cas12a seja poderoso para fazer cortes únicos, ele não possui atualmente a confiabilidade necessária para excisar loci alvo de uma forma que permita aos cientistas triar milhares de regiões genéticas de uma só vez. A falha provavelmente decorre do fato de que os dois cortes necessários para remover um segmento não ocorrem exatamente ao mesmo tempo em todas as células, ou que os mecanismos de reparo da célula nem sempre unem as extremidades de uma forma que delete a peça do meio. Até que as ferramentas possam ser melhoradas para realizar esses cortes simultâneos de forma mais consistente, este método específico de remoção de segmentos de DNA permanece inadequado para a exploração ampla e sistemática do genoma não codificante que os cientistas haviam vislumbrado.
Afogado em artigos na sua área?
Receba digests diários dos artigos mais recentes que correspondam às suas palavras-chave de pesquisa — com resumos técnicos, no seu idioma.