Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Questo studio dimostra che, sebbene CRISPR/Cas12a possa processare molteplici gRNA da un singolo promotore, la sua efficienza nell'escidere loci genomici mirati tramite rotture della doppia elica indotte da guide accoppiate è troppo bassa per supportare saggi di selezione negativa sensibili nelle cellule di mammifero.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Gran parte del genoma umano non è un progetto per la produzione di proteine, i mattoni che compongono i nostri corpi. Invece, la stragrande maggioranza del nostro DNA consiste in sequenze non codificanti che agiscono più come interruttori, regolatori di intensità e manuali di istruzioni, dicendo ai geni quando accendersi o spegnersi. Gli scienziati sospettano da tempo che queste regioni nascoste detengano le chiavi per comprendere molte malattie e tratti, eppure studiarle è difficile. Lo strumento standard per l'editing genetico, noto come CRISPR, funziona effettuando un singolo taglio nel DNA, il che di solito provoca un piccolo errore disordinato che interrompe la funzione di un gene. Sebbene questo sia eccellente per spegnere un gene che codifica una proteina, è spesso uno strumento troppo rozzo per le regioni non codificanti, dove l'obiettivo è rimuovere interamente un segmento specifico di DNA per vedere cosa succede quando viene rimosso. Per comprendere davvero queste regioni, i ricercatori hanno bisogno di un modo per ritagliare un pezzo preciso del genoma e osservare come reagisce la cellula, un processo che richiede di effettuare due tagli contemporaneamente e sperare che la cellula elimini il pezzo compreso tra di essi.
Un team di ricercatori si è messo alla prova per testare se una versione specifica del sistema CRISPR, chiamata Cas12a, potesse eseguire questa delicata operazione a doppio taglio con un'efficienza sufficiente da essere utilizzata in esperimenti su larga scala. A differenza del più comune strumento CRISPR, Cas12a ha la capacità unica di elaborare una lunga stringa di istruzioni in molti guide di taglio separati partendo da un unico punto iniziale. Questa caratteristica suggeriva che potesse essere il candidato perfetto per uno screening ad alto rendimento, in cui migliaano di diversi segmenti di DNA vengono testati simultaneamente per trovare quali siano essenziali per la sopravvivenza di una cellula. I ricercatori hanno progettato una massiccia libreria di istruzioni genetiche destinata a colpire le regioni appena prima e appena dopo sezioni specifiche di DNA sia in geni essenziali, senza i quali le cellule non possono vivere, sia in geni non essenziali, dai quali le cellule possono sopravvivere. Il piano era semplice: se il sistema avesse funzionato, l'enzima Cas12a avrebbe effettuato due tagli, la cellula avrebbe eliminato il segmento tra di essi e le cellule che portavano quelle istruzioni sarebbero morte se quel segmento fosse stato vitale.
Il team ha introdotto queste istruzioni in milioni di cellule di cancro alla pelle umana e ha osservato come cambiava la popolazione nell'arco di tre settimane. Si aspettavano che, se il sistema avesse rimosso con successo i segmenti essenziali, le cellule che portavano quelle specifiche istruzioni sarebbero scomparse dalla popolazione, proprio come accade quando un gene viene direttamente rotto. Tuttavia, i risultati sono stati lontani da ciò che speravano. Mentre i controlli funzionavano perfettamente — le cellule con le istruzioni per rompere direttamente i geni essenziali morivano come previsto — le cellule con le istruzioni per rimuovere i segmenti tra due tagli mostravano quasi nessun cambiamento nel loro numero. I segmenti di DNA venivano raramente rimossi. I ricercatori hanno analizzato i dati per vedere se potessero trovare un modello che facesse funzionare meglio il sistema. Hanno esaminato le sequenze specifiche delle istruzioni, la distanza tra i due tagli, la direzione verso cui i tagli erano rivolti e persino la composizione chimica del DNA nelle vicinanze. Nessuno di questi fattori faceva una differenza significativa. L'efficienza del metodo a doppio taglio rimaneva così bassa da essere indistinguibile dal caso, fallendo nel produrre il segnale chiaro necessario per identificare quali segmenti di DNA fossero critici.
Lo studio ha anche confrontato i loro risultati con un approccio simile utilizzato da un altro gruppo di ricerca che combinava due diversi enzimi CRISPR per raggiungere lo stesso obiettivo. Anche con quella configurazione più complessa, il tasso di successo per la rimozione dei segmenti di DNA era troppo basso per essere utile in screening su larga scala. Gli autori hanno concluso che, sebbene il sistema Cas12a sia potente per effettuare singoli tagli, non possiede attualmente l'affidabilità necessaria per estirpare loci mirati in modo da consentire agli scienziati di esaminare migliaia di regioni genetiche contemporaneamente. Il fallimento deriva probabilmente dal fatto che i due tagli necessari per rimuovere un segmento non avvengono esattamente nello stesso momento in ogni cellula, o che i meccanismi di riparazione della cellula non sempre uniscono le estremità in un modo che elimini il pezzo centrale. Finché gli strumenti non potranno essere migliorati per effettuare questi tagli simultanei in modo più costante, questo specifico metodo di rimozione dei segmenti di DNA rimane inadatto per l'esplorazione sistematica e ampia del genoma non codificante che gli scienziati avevano immaginato.
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