Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Deze studie toont aan dat hoewel CRISPR/Cas12a meerdere gRNA's van een enkele promotor kan verwerken, de efficiëntie ervan bij het exciseren van doelgerichte genomische loci via door paren van gidsen geïnduceerde dubbelstrengs breuken te laag is om gevoelige negatieve selectie-assays in zoogdiercellen te ondersteunen.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Het grootste deel van het menselijk genoom is geen blauwdruk voor het maken van eiwitten, de bouwstenen van ons lichaam. In plaats daarvan bestaat het overgrote deel van ons DNA uit niet-coderende sequenties die meer fungeren als schakelaars, dimmers en instructiehandleidingen, die genen vertellen wanneer ze aan of uit moeten gaan. Wetenschappers vermoeden al lang dat deze verborgen regio's de sleutels bevatten tot het begrijpen van veel ziekten en eigenschappen, maar het bestuderen ervan is moeilijk. Het standaardinstrument voor het bewerken van genen, bekend als CRISPR, werkt door een enkele knip in het DNA te maken, wat meestal resulteert in een kleine, slordige fout die de functie van een gen verstoort. Hoewel dit uitstekend is voor het uitschakelen van een eiwitcoderend gen, is het vaak te bot een instrument voor niet-coderende regio's, waar het doel is om een specifiek DNA-segment volledig te verwijderen om te zien wat er gebeurt als het weg is. Om deze regio's echt te begrijpen, hebben onderzoekers een manier nodig om een precies stuk van het genoom weg te knippen en te kijken hoe de cel reageert, een proces dat vereist dat er twee knips tegelijkertijd worden gemaakt en dat men erop hoopt dat de cel het stuk tussen de knips verwijdert.
Een team van onderzoekers zette zich in om te testen of een specifieke versie van het CRISPR-systeem, genaamd Cas12a, deze delicate dubbele knip-operatie efficiënt genoeg kon uitvoeren om te worden gebruikt in grootschalige experimenten. In tegen tegenstelling tot het meer gebruikelijke CRISPR-instrument, heeft Cas12a het unieke vermogen om een lange reeks instructies te verwerken tot vele afzonderlijke snijgidsen vanuit één enkel startpunt. Deze functie suggereerde dat het de perfecte kandidaat zou kunnen zijn voor een high-throughput screen, waarbij duizenden verschillende DNA-segmenten gelijktijdig worden getest om te vinden welke essentieel zijn voor het overleven van een cel. De onderzoekers ontwierpen een enorme bibliotheek van genetische instructies bedoeld om de regio's net vóór en net na specifieke secties van DNA te targeten in zowel essentiële genen, waar cellen niet zonder kunnen leven, als niet-essentiële genen, waar cellen zonder kunnen overleven. Het plan was simpel: als het systeem werkte, zou het Cas12a-enzym twee knips maken, de cel zou het segment tussen de knips verwijderen, en de cellen die deze instructies dragen zouden sterven als dat segment vitaal was.
Het team introduceerde deze instructies in miljoenen menselijke huidkankercellen en observeerde hoe de populatie gedurende drie weken veranderde. Ze verwachtten dat als het systeem de essentiële segmenten succesvol zou verwijderen, de cellen die die specifieke instructies dragen uit de populatie zouden verdwijnen, net zoals wanneer een gen direct wordt gebroken. De resultaten waren echter verre van wat ze hoopten. Terwijl de controles perfect werkten — cellen met instructies om essentiële genen direct te breken stierven zoals verwacht — vertoonden de cellen met instructies om de segmenten tussen twee knips te verwijderen bijna geen verandering in hun aantallen. De DNA-segmenten werden zelden verwijderd. De onderzoekers analyseerden de gegevens om te zien of ze een patroon konden vinden dat het systeem beter zou laten werken. Ze keken naar de specifieke sequenties van de instructies, de afstand tussen de twee knips, de richting waarin de knips gericht waren, en zelfs de chemische samenstelling van het nabijgelegen DNA. Geen van deze factoren maakte een betekenisvol verschil. De efficiëntie van de dubbele knipmethode bleef zo laag dat deze niet te onderscheiden was van willekeurige kans, waardoor het niet de duidelijke signalen produceerde die nodig zijn om te identificeren welke DNA-segmenten cruciaal zijn.
De studie vergeleek hun resultaten ook met een vergelijkbare aanpak die door een andere onderzoeksgroep werd gebruikt, waarbij twee verschillende CRISPR-enzymen werden gecombineerd om hetzelfde doel te bereiken. Zelfs met die complexere opstelling was het succespercentage voor het verwijderen van DNA-segmenten te laag om bruikbaar te zijn voor grootschalige screening. De auteurs concludeerden dat hoewel het Cas12a-systeem krachtig is voor het maken van enkele knips, het momenteel niet de betrouwbaarheid bezit die vereist is om doelgerichte loci te excideren op een manier die wetenschappers in staat stelt om duizenden genetische regio's tegelijkertijd te screenen. Het falen komt waarschijnlijk voort uit het feit dat de twee knips die nodig zijn om een segment te verwijderen, niet in elke cel op exact hetzelfde moment plaatsvinden, of dat de herstelmechanismen van de cel de uiteinden niet altijd op een manier verbinden die het middelste stuk verwijdert. Totdat de instrumenten verbeterd kunnen worden om deze gelijktijdige knips consistenter te maken, blijft deze specifieke methode voor het verwijderen van DNA-segmenten ongeschikt voor de brede, systematische verkenning van het niet-coderende genoom die wetenschappers voor ogen hadden.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.