Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
本研究は、CRISPR/Cas12aが単一のプロモーターから複数のgRNAをプロセシングできる一方で、対となるガイドによる二本鎖切断を介した標的ゲノム領域の切除効率は、哺乳類細胞における高感度なネガティブ選択アッセイを支えるには低すぎることを示している。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
ヒトゲノムの大部分は、私たちの体の構成要素であるタンパク質を作るための設計図ではありません。むしろ、DNAの大部分は、遺伝子がいつオンになり、いつオフになるかを指示する、スイッチやディマー（調光器）、あるいは取扱説明書のような役割を果たす非コード配列で構成されています。科学者たちは、長らくこれらの隠れた領域が多くの疾患や形質を理解するための鍵を握っていると考えてきましたが、それらを研究することは困難です。遺伝子編集の標準的なツールとして知られるCRISPRは、DNAに単一の切断を加えることで機能しますが、これは通常、遺伝子の機能を破壊する小さな、かつ乱雑なエラーをもたらします。これはタンパク質をコードする遺伝子をオフにするには優れていますが、特定のDNAセグメントを完全に除去して何が起こるかを確認することを目的とする非コード領域に対しては、あまりにも無骨な道具である場合が多いのです。これらの領域を真に理解するためには、研究者がゲノムの正確な塊を切り出し、細胞がどのように反応するかを観察する方法が必要であり、そのプロセスには、一度に2箇所の切断を行い、細胞がその間の断片を削除することを期待するという工程が求められます。
ある研究チームは、Cas12aと呼ばれる特定のバージョンのCRISPRシステムが、この繊細な二重切断操作を、大規模な実験に使用できるほど効率的に実行できるかどうかを検証するために調査を開始しました。より一般的なCRISPRツールとは異なり、Cas12aは、単一の開始点から長い一連の指示を多くの別々の切断ガイドへと処理できるというユニークな能力を持っています。この特徴は、細胞の生存に不可欠なDNAセグメントがどれであるかを特定するために、数千の異なるDNAセグメントを同時にテストするハイスループット・スクリーニングにおいて、Cas12aが完璧な候補になり得ることを示唆していました。研究者たちは、必須遺伝子（細胞が生存するために欠かせないもの）と非必須遺伝子（細胞が生存できるもの）の両方において、特定のDNAセクションの直前および直後の領域を標的とする膨大な遺伝子指示ライブラリを設計しました。計画は単純でした。もしシステムが機能すれば、Cas12a酵素が2箇所の切断を行い、細胞はその間のセグメントを削除し、それらの指示を持つ細胞は、もしそのセグメントが極めて重要であれば死滅するというものです。
チームはこれらの指示を数百万個のヒト皮膚癌細胞に導入し、3週間にわたって集団がどのように変化するかを観察しました。彼らは、もしシステムが必須セグメントを正常に除去できれば、必須遺伝子を直接破壊する指示を持つ細胞が予想通りに消失するように、指示によって直接遺伝子を壊すコントロール群と同様の結果が得られると考えていました。しかし、結果は期待とは程遠いものでした。コントロール群は完璧に機能し、必須遺伝子を直接破壊する指示を持つ細胞は予想通り死滅しましたが、2つの切断の間のセグメントを除去する指示を持つ細胞の数は、ほとんど変化を示しませんでした。DNAセグメントはめったに除去されていなかったのです。研究者たちは、システムをより良く機能させるためのパターンが見つかるかどうか、データを分析しました。彼らは、指示の特定の配列、切断間の距離、切断の向き、さらには近くのDNAの化学組成までを調べました。これらの要因のいずれもが意味のある差を生み出すことはありませんでした。二重切断法の効率はあまりにも低く、ランダムな偶然と区別がつかないほどであり、どのDNAセグメントが重要であるかを特定するために必要な明確なシグナルを生み出すことができませんでした。
この研究はまた、同じ目的を達成するために2種類の異なるCRISPR酵素を組み合わせた別の研究グループによる同様のアプローチとも比較を行いました。より複雑なセットアップを用いたとしても、DNAセグメントを除去する成功率は、大規模なスクリーニングに利用するには低すぎました。著者らは、Cas12aシステムは単一の切断を行う上では強力ですが、科学者が数千の遺伝領域を一度にスクリーニングすることを可能にするような、標的された遺伝子座を切り出すために必要な信頼性は、現時点では備えていないと結論付けました。この失敗は、おそらく、セグメントを除去するために必要な2つの切断がすべての細胞で同時に起こるわけではないこと、あるいは、細胞の修復メカニズムが必ずしも真ん中の断片を削除するように両端を結合させるとは限らないことに起因しています。ツールがこれらの同時切断をより一貫して行うように改善されない限り、この特定のDNAセグメント除去法は、科学者が思い描いた非コードゲノムの広範かつ体系的な探索には不適当なままです。
自分の分野の論文に埋もれていませんか？
研究キーワードに一致する最新の論文のダイジェストを毎日受け取りましょう——技術要約付き、あなたの言語で。