Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Diese Studie zeigt, dass CRISPR/Cas12a zwar in der Lage ist, mehrere gRNAs aus einem einzelnen Promotor zu prozessieren, seine Effizienz bei der Exzision gezielter genomischer Loci mittels paarweise induzierter Doppelstrangbrüche jedoch zu gering ist, um sensitive negative Selektionsassays in Säugetierzellen zu unterstützen.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Der Großteil des menschlichen Genoms ist kein Bauplan für die Herstellung von Proteinen, den Bausteinen unseres Körpers. Stattdessen besteht der weitahe gesamte Teil unserer DNA aus nicht-kodierenden Sequenzen, die eher wie Schalter, Dimmer und Bedienungsanleitungen fungieren und Gene steuern, wann sie ein- oder ausgeschaltet werden sollen. Wissenschaftler vermuten schon lange, dass diese verborgenen Regionen die Schlüssel zum Verständnis vieler Krankheiten und Merkmale enthalten, doch ihre Untersuchung gestaltet sich schwierig. Das Standardwerkzeug zur Editierung von Genen, bekannt als CRISPR, funktioniert durch das Setzen eines einzelnen Schnitts in die DNA, was in der Regel zu einem kleinen, unordentlichen Fehler führt, der die Funktion eines Gens unterbricht. Während dies hervorragend geeignet ist, um ein protein-kodierendes Gen auszuschalten, ist es für nicht-kodierende Regionen oft zu stumpfes Instrument, da dort das Ziel darin besteht, ein spezifisches DNA-Segment vollständig zu entfernen, um zu sehen, was passiert, wenn es fehlt. Um diese Regionen wirklich zu verstehen, benötigen Forscher eine Möglichkeit, ein präzises Stück des Genoms herauszuschneiden und zu beobachten, wie die Zelle darauf reagiert – ein Prozess, der erfordert, zwei Schnitte gleichzeitig zu setzen und zu hoffen, dass die Zelle das Stück zwischen ihnen löscht.
Ein Forschungsteam setzte sich zum Ziel zu testen, ob eine spezifische Version des CRISPR-Systems, genannt Cas12a, in der Lage ist, diese präzise Doppel-Schnitt-Operation effizient genug durchzuführen, um für groß angelegte Experimente genutzt werden zu können. Im Gegensatz zum bekannteren CRISPR-Werkzeug besitzt Cas12a die einzigartige Fähigkeit, eine lange Kette von Anweisungen von einem einzigen Ausgangspunkt aus in viele separate Schnittführungen zu verarbeiten. Diese Eigenschaft deutet darauf darauf hin, dass es der perfekte Kandidat für ein Hochdurchsatz-Screening sein könnte, bei dem tausende verschiedene DNA-Segmente gleichzeitig getestet werden, um herauszufinden, welche für das Überleben einer Zelle essenziell sind. Die Forscher entwarfen eine massive Bibliothek genetischer Anweisungen, die darauf abzielen, die Regionen unmittelbar vor und nach spezifischen Abschnitten der DNA sowohl in essenziellen Genen, ohne die Zellen nicht leben können, als auch in nicht-essentiellen Genen, mit denen Zellen überleben können, zu treffen. Der Plan war simpel: Wenn das System funktioniert, würde das Cas12a-Enzym zwei Schnitte setzen, die Zelle würde das Segment zwischen ihnen löschen, und die Zellen, die diese Anweisungen tragen, würden sterben, falls dieses Segment lebensnotwendig ist.
Das Team führte diese Anweisungen in Millionen von menschlichen Hautkrebszellen ein und beobachtete über drei Wochen hinweg, wie sich die Population veränderte. Sie erwarteten, dass – falls das System die Segmente erfolgreich entfernt – die Zellen, die diese spezifischen Anweisungen tragen, aus der Population verschwinden würden, genau wie dann, wenn ein Gen direkt unterbrochen wird. Die Ergebnisse waren jedoch weit entfernt von dem, was sie sich erhofft hatten. Während die Kontrollen perfekt funktionierten – Zellen mit Anweisungen, die direkt essenzielle Gene unterbrechen, starben wie erwartet –, zeigten die Zellen mit Anweisungen, die Segmente zwischen zwei Schnitten zu entfernen, fast keine Veränderung in ihrer Anzahl. Die DNA-Segmente wurden selten entfernt. Die Forscher analysierten die Daten, um zu sehen, ob sie ein Muster finden könnten, das das System besser funktionieren ließe. Sie untersuchten die spezifischen Sequenzen der Anweisungen, den Abstand zwischen den beiden Schnitten, die Richtung, in die die Schnitte zeigten, und sogar die chemische Zusammensetzung der angrenzenden DNA. Keiner dieser Faktoren machte einen bedeutsamen Unterschied. Die Effizienz der Doppel-Schnitt-Methode blieb so gering, dass sie nicht von dem Zufall zu unterscheiden war, und sie konnte nicht das klare Signal liefern, das nötig wäre, um zu identifizieren, welche DNA-Segmente kritisch sind.
Die Studie verglich ihre Ergebnisse auch mit einem ähnlichen Ansatz einer anderen Forschungsgruppe, die zwei verschiedene CRISPR-Enzyme kombinierte, um dasselbe Ziel zu erreichen. Selbst mit diesem komplexeren Aufbau war die Erfolgsrate für das Entfernen von DNA-Segmenten zu niedrig, um für groß angelegte Screenings nützlich zu sein. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass das Cas12a-System zwar leistungsstark beim Erzeugen einzelner Schnitte ist, aber derzeit nicht über die erforderliche Zuverlässigkeit verfügt, um gezielte Loci so zu exzidieren, dass Wissenschaftler tausende genetische Regionen gleichzeitig screenen können. Das Scheitern ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die beiden Schnitte, die zum Entfernen eines Segments nötig sind, nicht in jeder Zelle zum exakt gleichen Zeitpunkt erfolgen oder dass die Reparaturmechanismen der Zelle die Enden nicht immer so verbinden, dass das mittlere Stück gelöscht wird. Bis die Werkzeuge verbessert werden können, um solche simultanen Schnitte konsistenter zu setzen, bleibt diese spezifische Methode des Entfernens von DNA-Segmenten für die breite, systematische Erkundung des nicht-kodierenden Genoms, wie sie sich die Wissenschaftler vorgestellt hatten, ungeeignet.
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