Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Este estudio demuestra que, si bien CRISPR/Cas12a puede procesar múltiples gRNAs a partir de un solo promotor, su eficiencia para escindir loci genómicos específicos mediante roturas de doble cadena inducidas por guías pareadas es demasiado baja como para sustentar ensayos de selección negativa sensibles en células de mamíferos.
Artículo original bajo licencia CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Esta es una explicación generada por IA de un preprint que no ha sido revisado por pares. No es consejo médico. No tome decisiones de salud basándose en este contenido. Leer descargo de responsabilidad completo
La mayor parte del genoma humano no es un plano para fabricar proteínas, los bloques de construcción de nuestros cuerpos. En su lugar, la gran mayoría de nuestro ADN consiste en secuencias no codificantes que actúan más bien como interruptores, reguladores de intensidad y manuales de instrucciones, indicando a los genes cuándo encenderse o apagarse. Los científicos han sospechado durante mucho tiempo que estas regiones ocultas contienen las claves para comprender muchas enfermedades y rasgos, pero estudiarlas es difícil. La herramienta estándar para editar genes, conocida como CRISPR, funciona realizando un único corte en el ADN, lo que suele resultar en un error pequeño y desordenado que rompe la función de un gen. Si bien esto es excelente para desactivar un gen que codifica una proteína, suele ser un instrumento demasiado tosco para las regiones no codificantes, donde el objetivo es eliminar por completo un segmento específico de ADN para ver qué sucede cuando desaparece. Para comprender verdaderamente estas regiones, los investigadores necesitan una forma de recortar un fragmento preciso del genoma y observar cómo reacciona la célula, un proceso que requiere realizar dos cortes a la vez y esperar que la célula elimine la pieza que hay entre ellos.
Un equipo de investigadores se propuso probar si una versión específica del sistema CRISPR, llamada Cas12a, podía realizar esta delicada operación de doble corte con la eficiencia suficiente como para ser utilizada en experimentos a gran escala. A diferencia de la herramienta CRISPR más común, Cas12a tiene la capacidad única de procesar una larga cadena de instrucciones en muchos guías de corte separados a partir de un único punto de partida. Esta característica sugirió que podría ser el candidato perfecto para un cribado de alto rendimiento, donde se prueban miles de diferentes segmentos de ADN simultáneamente para encontrar cuáles son esenciales para la supervivencia de una célula. Los investigadores diseñaron una biblioteca masiva de instrucciones genéticas destinadas a dirigirse a las regiones justo antes y justo después de secciones específicas de ADN, tanto en genes esenciales, sin los cuales las células no pueden vivir, como en genes no esenciales, sin los cuales las células pueden sobrevivir. El plan era sencillo: si el sistema funcionaba, la enzima Cas12a realizaría dos cortes, la célula eliminaría el segmento entre ellos y las células que portaran estas instrucciones morirían si ese segmento fuera vital.
El equipo introdujo estas instrucciones en millones de células de cáncer de piel humano y observó cómo cambiaba la población durante tres semanas. Esperaban que, si el sistema eliminaba con éxito los segmentos, las células que portaran esas instrucciones específicas desaparecerían de la población, tal como ocurre cuando se rompe directamente un gen. Sin embargo, los resultados estuvieron lejos de lo que esperaban. Aunque los controles funcionaron perfectamente —las células con instrucciones para romper directamente genes esenciales murieron como se esperaba—, las células con instrucciones para eliminar los segmentos entre dos cortes mostraron casi ningún cambio en su número. Los segmentos de ADN rara vez estaban siendo eliminados. Los investigadores analizaron los datos para ver si podían encontrar un patrón que hiciera que el sistema funcionara mejor. Examinaron las secuencias específicas de las instrucciones, la distancia entre los dos cortes, la dirección hacia la que apuntaban los cortes e incluso la composición química del ADN cercano. Ninguno de estos factores marcó una diferencia significativa. La eficiencia del método de doble corte siguió siendo tan baja que resultaba indistinguible del azar, sin producir la señal clara necesaria para identificar qué segmentos de ADN eran críticos.
El estudio también comparó sus resultados con un enfoque similar utilizado por otro grupo de investigación que combinó dos enzimas CRISPR diferentes para lograr el mismo objetivo. Incluso con esa configuración más compleja, la tasa de éxito para eliminar segmentos de ADN fue demasiado baja para ser útil en cribados a gran escala. Los autores concluyeron que, si bien el sistema Cas12a es potente para realizar cortes únicos, actualmente no posee la fiabilidad necesaria para escindir loci específicos de una manera que permita a los científicos cribar miles de regiones genéticas a la vez. El fallo probablemente se deba a que los dos cortes necesarios para eliminar un segmento no ocurren exactamente al mismo tiempo en cada célula, o a que los mecanismos de reparación de la célula no siempre unen los extremos de una manera que elimine la pieza central. Hasta que las herramientas puedan mejorarse para realizar estos cortes simultáneos de forma más constante, este método específico de eliminación de segmentos de ADN sigue siendo inadecuado para la exploración amplia y sistemática del genoma no codificante que los científicos habían imaginado.
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