Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
Cette étude démontre que bien que CRISPR/Cas12a puisse traiter plusieurs gRNA à partir d'un seul promoteur, son efficacité pour l'excision de locus génomiques ciblés via des cassures double-brin induites par des guides appariés est trop faible pour permettre des essais de sélection négative sensibles dans les cellules mammaliennes.
Article original sous licence CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Ceci est une explication générée par l'IA d'un preprint qui n'a pas été évalué par des pairs. Ce n'est pas un avis médical. Ne prenez pas de décisions de santé basées sur ce contenu. Lire la clause de non-responsabilité complète
La majeure partie du génome humain n'est pas un plan pour la fabrication de protéines, les blocs de construction de nos corps. Au lieu de cela, la grande majorité de notre ADN se compose de séquences non codantes qui agissent plutôt comme des interrupteurs, des variateurs et des manuels d'instructions, indiquant aux gènes quand s'activer ou se désactiver. Les scientifiques soupçonnent depuis longtemps que ces régions cachées détiennent les clés de la compréhension de nombreuses maladies et de nombreux traits, pourtant leur étude est difficile. L'outil standard pour l'édition de gènes, connu sous le nom de CRISPR, fonctionne en effectuant une coupure unique dans l'ADN, ce qui entraîne généralement une petite erreur désordonnée qui casse la fonction d'un gène. Bien que cela soit excellent pour désactiver un gène codant pour une protéine, c'est souvent un instrument trop rudimentaire pour les régions non codantes, où l'objectif est de supprimer entièrement un segment spécifique d'ADN pour voir ce qui se passe lorsqu'il disparaît. Pour véritablement comprendre ces régions, les chercheurs ont besoin d'un moyen de découper un morceau précis du génome et d'observer la réaction de la cellule, un processus qui nécessite de réaliser deux coupures simultanées et d'espérer que la cellule supprime la partie située entre elles.
Une équipe de chercheurs s'est donné pour mission de tester si une version spécifique du système CRISPR, appelée Cas12a, pouvait effectuer cette opération délicate de double coupure de manière assez efficace pour être utilisée dans des expériences à grande échelle. Contra manirement à l'outil CRISPR plus courant, Cas12a possède la capacité unique de traiter une longue chaîne d'instructions en de nombreux guides de coupure distincts à partir d'un seul point de départ. Cette caractéristique suggérait qu'il pourrait être le candidat parfait pour un criblage à haut débit, où des milliers de segments d'ADN différents sont testés simultanément pour déterminer lesquels sont essentiels à la survie d'une cellule. Les chercheurs ont conçu une immense bibliothèque d'instructions génétiques destinées à cibler les régions situées juste avant et juste après des sections spécifiques d'ADN, tant dans les gènes essentiels, sans lesquels les cellules ne peuvent vivre, que dans les gènes non essentiels, dont les cellules peuvent se passer. Le plan était simple : si le système fonctionnait, l'enzyme Cas12a effectuerait deux coupures, la cellule supprimerait le segment situé entre elles, et les cellules portant ces instructions mourraient si ce segment était vital.
L'équipe a introduit ces instructions dans des millions de cellules de cancer de la peau humaine et a observé comment la population évoluait sur trois semaines. Ils s'attendaient à ce que, si le système supprimait avec succès les segments, les cellules portant ces instructions spécifiques disparaissent de la population, tout comme lorsqu'un gène est directement cassé. Cependant, les résultats étaient loin de ce qu'ils espéraient. Alors que les contrôles fonctionnaient parfaitement — les cellules avec des instructions pour casser directement des gènes essentiels mouraient comme prévu — les cellules avec des instructions pour supprimer les segments entre deux coupures ne montraient presque aucun changement dans leur nombre. Les segments d'ADN étaient rarement supprimés. Les chercheurs ont analysé les données pour voir s'ils pouvaient trouver un modèle qui permettrait au système de mieux fonctionner. Ils ont examiné les séquences spécifiques des instructions, la distance entre les deux coupures, la direction des coupures, et même la composition chimique de l'ADN à proximité. Aucun de ces facteurs n'a fait de différence significative. L'efficacité de la méthode de double coupure est restée si faible qu'elle était indiscernable du hasard, échouant à produire le signal clair nécessaire pour identifier quels segments d'ADN sont critiques.
L'étude a également comparé leurs résultats à une approche similaire utilisée par un autre groupe de recherche qui combinait deux enzymes CRISPR différentes pour atteindre le même objectif. Même avec cette configuration plus complexe, le taux de réussite pour la suppression de segments d'ADN était trop faible pour être utile à un criblage à grande échelle. Les auteurs ont conclu que, bien que le système Cas12a soit puissant pour effectuer des coupures uniques, il ne possède pas actuellement la fiabilité requise pour exciser des locus ciblés de manière à permettre aux scientifiques de cribler des milliers de régions génétiques à la fois. L'échec provient probablement du fait que les deux coupures nécessaires pour supprimer un segment ne se produisent pas exactement au même moment dans chaque cellule, ou que les mécanismes de réparation de la cellule ne joignent pas toujours les extrémités de manière à supprimer la pièce centrale. Tant que les outils ne pourront pas être améliorés pour réaliser ces coupures simultanées de manière plus constante, cette méthode spécifique de suppression de segments d'ADN reste inappropriée pour l'exploration large et systématique du génome non codant que les scientifiques avaient envisagée.
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