Combinatorial CRISPR/Cas12a excises targeted loci in the mammalian genome at very low efficiency
这项研究表明，尽管 CRISPR/Cas12a 可以从单个启动子中处理多个 gRNA，但其通过配对引导诱导的双链断裂来切除靶向基因组位点的效率过低，不足以支持哺乳动物细胞中的敏感负向选择实验。
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人类基因组的大部分并不是制造蛋白质（我们身体的构建模块）的蓝图。相反，我们绝大部分的 DNA 由非编码序列组成，它们更像是开关、调光器和说明书，指示基因何时开启或关闭。科学家长期以来一直怀疑，这些隐藏区域持有理解许多疾病和性状的关键，然而研究它们却十分困难。被称为 CRISPR 的标准基因编辑工具通过在 DNA 中制造单个切口来工作，这通常会导致一个微小的、混乱的错误，从而破坏基因的功能。虽然这对于关闭一个蛋白质编码基因非常有效，但对于非编码区域来说，它往往显得过于粗糙，因为在这些区域，目标是完全移除特定的 DNA 片段，以观察移除后会发生什么。要真正理解这些区域，研究人员需要一种能够精准剪切出一块基因组片段并观察细胞反应的方法，这一过程需要同时进行两次切割，并寄希望于细胞删除两者之间的部分。
一个研究小组着手测试一种特定版本的 CRISPR 系统（称为 Cas12a）是否能够高效地执行这种精细的双切操作，以用于大规模实验。与更常见的 CRISPR 工具不同，Cas12a 具有将一段长指令处理成许多独立切割引导序列的独特能力。这一特性表明，它可能是进行高通量筛选的理想候选者，在这种筛选中，数千个不同的 DNA 片段会被同时进行测试，以寻找哪些片段对细胞生存至关重要。研究人员设计了一个庞大的遗传指令库，旨在针对必需基因（细胞无法生存所需的基因）和非必需基因（细胞可以生存而无需这些基因）中特定 DNA 段的前后区域。计划很简单：如果该系统奏效，Cas12a 酶将进行两次切割，细胞将删除中间的片段，而携带这些指令的细胞如果该片段至关重要，则会死亡。
研究小组将这些指令引入数百万个人类皮肤癌细胞中，并在三周内观察种群的变化。他们预期，如果系统成功移除了这些片段，携带这些特定指令的细胞将从种群中消失，就像直接破坏基因时那样。然而，结果远未达到他们的预期。虽然对照组表现完美——即带有直接破坏必需基因指令的细胞如期死亡——但携带两处切割之间移除指令的细胞数量几乎没有变化。DNA 片段很少被移除。研究人员分析了数据，试图寻找可能使系统运行得更好的模式。他们研究了指令的具体序列、两次切割之间的距离、切割的方向，甚至附近 DNA 的化学组成。所有这些因素都没有产生显著差异。双切方法的效率依然极低，甚至无法与随机概率区分开来，未能产生识别哪些 DNA 片段至关重要的清晰信号。
该研究还将其结果与另一研究小组使用结合两种不同 CRISPR 酶来实现相同目标的类似方法进行了比较。即使是采用那种更复杂的设置，移除 DNA 片段的成功率也太低，无法投入大规模筛选。作者得出结论，虽然 Cas12a 系统在进行单次切割方面功能强大，但目前尚不具备通过切除靶向位点来进行大规模筛选所需的可靠性。失败的原因可能在于，移除一个片段所需的两次切割并非在每个细胞中都同时发生，或者细胞的修复机制并不总是以能删除中间部分的方式连接末端。在工具能够改进以更一致地实现这些同步切割之前，这种特定的移除 DNA 片段的方法仍不适用于科学家所设想的对非编码基因组进行的广泛且系统的探索。
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