The Pan-African Natural Products Library compounds oleanolic acid, poinsettifolin B, and rhuschalcone III disrupt SARS-CoV-2 Spike-host ACE2 interactions and SARS-CoV-2 replication

技术摘要：泛非天然产物库化合物——齐墩果酸、Poinsettifolin B 和 Rhuschalcone III 作为 SARS-CoV-2 抑制剂的研究

问题陈述
在低收入和中等收入国家（LMICs），获取 SARS-CoV-2 疫苗和治疗药物的机会仍然不均衡，这些国家的人口通常依赖当地药用植物进行基础医疗保健。目前迫切需要识别能够抑制 SARS-CoV-2 复制或破坏病毒进入机制的、易于获取的本地天然产物（NPs）。泛非天然产物库（p-ANAPL）是一个包含 500 多种从非洲药用植物中提取的纯物理化合物的集合，代表了一个潜在的抗病毒先导化合物来源，该库此前已在针对艾滋病毒（HIV）、流感病毒及去乙酰化酶（sirtuin）抑制的研究中取得了成果。

方法论
本研究采用多阶段筛选和计算方法来评估 p-ANAPL 化合物对 SARS-CoV-2 的作用：

1. 高通量筛选（AlphaScreen）： 使用蛋白质-蛋白质相互作用分析法，筛选了 213 种 p-ANAPL 化合物，以评估其破坏 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域（RBD）与宿主 ACE2 受体之间结合的能力。测试浓度为 1 µg/mL。
2. 选择性评估： 对活性最强的命中化合物进行剂量反应研究，以确定其针对 RBD/ACE2 结合的半最大抑制浓度（IC50）。为了评估选择性，这些化合物还针对无关的宿主配体/受体对（PD-1/PD-L1）进行了测试。
3. 病毒复制与细胞毒性实验： 在生物安全三级（BSL-3）设施中，使用 Vero-E6 细胞感染 SARS-CoV-2（USA-WA1/2020），并加入候选化合物。在 96 小时后，使用基于分生素（resazurin）的细胞活力检测法对病毒复制进行定量。同时在未感染细胞上进行的平行实验用于确定固有细胞毒性（CC50），从而计算选择性指数。
4. 计算建模：
   • 分子对接： 使用 Schrödinger 套件（Glide）将化合物对接至 RBD/ACE2 复合物（PDB ID: 6M0J）。评分采用标准精度（SP）Glide 评分。
   • 重评分： 采用 Prime MM-GBSA 计算结合自由能（ΔGbind）和溶剂化能（ΔGsolv）。
   • 生成式建模： 使用 REINVENT4 生成器进行 de novo（从头开始）设计，基于活性命中化合物生成新型类似物，以探索更优的结合亲和力。
   • 类似物筛选： 通过搜索 PubChem 数据库识别出与 rhuschalcone III 结构相似度 ≥95% 的类似物，用于对接分析。

关键结果

• 活性化合物的鉴定： 筛选确定了三种在 1 µg/mL 时能抑制至少 80% RBD/ACE2 结合的化合物：齐墩果酸（oleanolic acid）、poinsettifolin B 和 rhuschalcone III。
• 效力与选择性：
  • IC50 (RBD/ACE2)： 齐墩果酸 (2.4 µM)，poinsettifolin B (0.50 µM)，以及 rhuschalcone III (0.81 µM)。
  • 选择性： 这三种化合物对 RBD/ACE2 相较于 PD-1/PD-L1 均表现出高度选择性，选择性指数分别为 5.2、>21.4 和 >23.5。
• 抗病毒活性与细胞毒性：
  • 齐墩果酸： 以 10.8 µM 的 EC50 抑制了 SARS-CoV-2 的复制。然而，它表现出脱靶细胞毒性（CC50 = 19.9 µM），导致选择性指数仅为 1.8。
  • Rhuschalcone III： 显示出微弱但稳定的抗病毒活性（在 3 µM 时抑制率约为 20%），其 CC50 为 9.3 µM。
  • Poinsettifolin B： 在测试浓度下未能抑制病毒复制，但表现出细胞毒性（CC50 = 10.8 µM）。
• 计算学见解：
  • 结合模式： Rhuschalcone III 表现出最强的预测结合亲和力（ΔGbind = −42.29 kcal/mol），其次是 poinsettifolin B (−34.37 kcal/mol) 和齐墩果酸 (−29.29 kcal/mol)。范德华相互作用是结合的主要驱动力，尽管 rhuschalcone III 表现出显著的静电贡献。
  • 残基相互作用： 齐墩果酸与在 SARS-CoV-2 各变异株（Alpha、Beta、Delta、Omicron）中保持保守的残基发生相互作用。相比之下，poinsettifolin B 和 rhuschalcone III 与已知会发生突变的残基（Tyr505, Lys417）发生相互作用，这表明它们可能易受病毒进化影响。
  • 生成式建模： De novo 设计生成的类似物具有比母体化合物更优的预测结合自由能。例如，rhuschalcone III 的类似物（如 RS_098）其 ΔGbind 值低至 −64.18 kcal/mol。
  • 类似物筛选： 对 rhuschalcone III 类似物的搜索得到了 12 个顶级候选物，其对接评分范围为 −6.024 至 −7.495 kcal/mol，均显示出比母体化合物更优的预测结合亲和力。

意义与主张
作者得出结论，p-ANAPL 是针对 SARS-CoV-2 入侵和复制的新型抗病毒先导化合物的有效来源。该研究验证了筛选非洲药用植物衍生的化合物以破坏 RBD/ACE2 的策略。

• 齐墩果酸被证实是 RBD/ACE2 结合的选择性破坏者及病毒复制抑制剂，支持其作为药物开发支架的潜力，尤其是考虑到其已知的安全性特征和合成可及性。
• Poinsettifolin B 和 rhuschalcone III 在此处首次被报道为 SARS-CoV-2 抑制剂。虽然 poinsettifolin B 在本次特定实验中缺乏抗病毒活性，但 rhuschalcone III 同时展示了进入抑制和微弱的复制抑制作用。
• 研究强调了 rhuschalcone III 作为理性药物设计理想支架的地位。通过鉴定具有更优预测结合亲和力的结构类似物，表明对这类双查尔酮（bichalcone）家族进行化学修饰可以产生更强效的抑制剂。
• 该研究强调了这些天然产物在西方疗法无法获得、资源匮乏的环境下，作为管理 COVID-19 的“易于获取的选择”的潜力。

本文对于临床应用的语气较为审慎，将其定位为“新型抗病毒先导化合物”和“生物探针”，旨在进行进一步的机制阐明和前临床优化，而非即时的治疗方案。